在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的...在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的克隆质粒p MD18-T-6R。再构建原核表达质粒p ET-32a-6R,进行测序,并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对,该扩增片段与预期一致,其编码分子量约为27 k D、含236个氨基酸的蛋白,与水产动物病毒US22蛋白家族(US22 family protein)成员有很高的同源性。然后对p ET-32a-6R进行转化、诱导表达,并利用Ni-NTA His-Bind亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析,结果显示,获得与预测分子量相符的45 k D融合蛋白(27 k D目的蛋白与18 k D His标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料。展开更多
为了更好地了解大鲵在感染蛙病毒过程中的生理生化及抗病毒反应,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)辅以密度分析,对大鲵正常血清和感染血清、正常黏液和感染黏液的蛋白图谱分别进行测试比较。结果显示:在正常血清(CS)、...为了更好地了解大鲵在感染蛙病毒过程中的生理生化及抗病毒反应,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)辅以密度分析,对大鲵正常血清和感染血清、正常黏液和感染黏液的蛋白图谱分别进行测试比较。结果显示:在正常血清(CS)、包括自然感染血清(NS)和人工感染血清(AS)在内的感染血清中,蛋白带集中在60—80 k D,其含量超过血清蛋白总量的42%;正常血清在14—57 k D之间有16条蛋白带:57、53、50、43、40、38、36、31、27、26、25、22、16、15.5、15和14 k D,其中正常与感染血清(包括NS和AS)比较,有10条共有蛋白带:57、43、40、31、27、26、25、15.5、15和14 k D和4条差异蛋白带:53、33、22和16 k D。正常黏液(CM)和感染黏液(NM或AM)共有11条蛋白带:116、100、75、57、53、45、27、18、17、16和15 k D,但感染黏液多出7条蛋白带:90、52、43、32、26、20和13 k D。还有些蛋白带含量出现变化,如45 k D条带在CM中占总蛋白量的19.3%,而在AM中仅占总蛋白的3.8%。研究证实蛙病毒感染能导致大鲵黏液和血清蛋白图谱发生变化,也为深入探寻两栖类抗病毒相关的蛋白生物标记提供了有价值的信息。展开更多
【背景】腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关。近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因。【目的】大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科...【背景】腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关。近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因。【目的】大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科,是世界现存最大两栖动物——中国大鲵的致死性病毒病原体。为了鉴定病毒基因及其表达产物对病毒复制和宿主细胞的影响,对ADRV编码ATPase的基因ADRV-96L进行了克隆、表达及功能分析,阐明这个虹彩病毒核心基因的功能。【方法】采用Predic Protein软件分析序列,构建重组原核表达质粒p ET32a/His ADRV-96L,经IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导在大肠杆菌DE3中表达蛋白,用镍树脂纯化和咪唑液洗脱。钼蓝分光光度法检测产生的无机磷(Pi)以确定纯化ADRV-96L的ATPase活性。建立表达蛋白的稳定转染细胞系并进行鉴定,再分别通过绘制病毒的一步生长曲线和评估转染细胞的生长速率来测定该蛋白对病毒复制及细胞生长的影响。【结果】多重序列比对显示ADRV-96L存在含Walker A和Walker B基序的AAA-ATPase(ATPases associated with a variety of cellular activities,与各种细胞活性相关的ATPase)结构域(20-159位氨基酸)及两个高度保守的精氨酸。重组原核质粒表达了含ADRV-96L的52 k D融合蛋白,该蛋白质具有ATPase活性(酶的比活性平均为4.68 U/mg)。结果未检出ADRV-96L对病毒的复制影响,但显示该蛋白可促细胞生长。【结论】大鲵蛙病毒96L基因(ADRV-96L)编码一个促细胞增殖和生长的ATPase。展开更多
为了进行大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)的早期诊断,以US22家族基因作为靶基因,建立大鲵蛙病毒Taq Man MGB实时荧光定量PCR检测方法,同时对该方法进行特异性、敏感性、重复性评估,并对73份未知大鲵血液样品进行...为了进行大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)的早期诊断,以US22家族基因作为靶基因,建立大鲵蛙病毒Taq Man MGB实时荧光定量PCR检测方法,同时对该方法进行特异性、敏感性、重复性评估,并对73份未知大鲵血液样品进行检测。结果显示,标准曲线在所选浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.997;该方法对大鲵蛙病毒的检测有高度特异性,与其他8种病毒或细菌之间均无交叉反应;灵敏性良好,能检测到2.00×101copies/L的标准品浓度,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复的变异系数均小于2%,重复性好;在73份未知样品检测中,Taq Man MGB实时荧光定量PCR能够检测到更低浓度的病毒,较常规PCR的敏感性更佳。鉴于该方法快速、特异、敏感、可重复、可定量的优点,对大鲵蛙病毒早期潜伏感染的快速诊断具有重要意义。展开更多
文摘在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的克隆质粒p MD18-T-6R。再构建原核表达质粒p ET-32a-6R,进行测序,并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对,该扩增片段与预期一致,其编码分子量约为27 k D、含236个氨基酸的蛋白,与水产动物病毒US22蛋白家族(US22 family protein)成员有很高的同源性。然后对p ET-32a-6R进行转化、诱导表达,并利用Ni-NTA His-Bind亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析,结果显示,获得与预测分子量相符的45 k D融合蛋白(27 k D目的蛋白与18 k D His标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料。
文摘为了更好地了解大鲵在感染蛙病毒过程中的生理生化及抗病毒反应,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)辅以密度分析,对大鲵正常血清和感染血清、正常黏液和感染黏液的蛋白图谱分别进行测试比较。结果显示:在正常血清(CS)、包括自然感染血清(NS)和人工感染血清(AS)在内的感染血清中,蛋白带集中在60—80 k D,其含量超过血清蛋白总量的42%;正常血清在14—57 k D之间有16条蛋白带:57、53、50、43、40、38、36、31、27、26、25、22、16、15.5、15和14 k D,其中正常与感染血清(包括NS和AS)比较,有10条共有蛋白带:57、43、40、31、27、26、25、15.5、15和14 k D和4条差异蛋白带:53、33、22和16 k D。正常黏液(CM)和感染黏液(NM或AM)共有11条蛋白带:116、100、75、57、53、45、27、18、17、16和15 k D,但感染黏液多出7条蛋白带:90、52、43、32、26、20和13 k D。还有些蛋白带含量出现变化,如45 k D条带在CM中占总蛋白量的19.3%,而在AM中仅占总蛋白的3.8%。研究证实蛙病毒感染能导致大鲵黏液和血清蛋白图谱发生变化,也为深入探寻两栖类抗病毒相关的蛋白生物标记提供了有价值的信息。
文摘【背景】腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关。近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因。【目的】大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科,是世界现存最大两栖动物——中国大鲵的致死性病毒病原体。为了鉴定病毒基因及其表达产物对病毒复制和宿主细胞的影响,对ADRV编码ATPase的基因ADRV-96L进行了克隆、表达及功能分析,阐明这个虹彩病毒核心基因的功能。【方法】采用Predic Protein软件分析序列,构建重组原核表达质粒p ET32a/His ADRV-96L,经IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导在大肠杆菌DE3中表达蛋白,用镍树脂纯化和咪唑液洗脱。钼蓝分光光度法检测产生的无机磷(Pi)以确定纯化ADRV-96L的ATPase活性。建立表达蛋白的稳定转染细胞系并进行鉴定,再分别通过绘制病毒的一步生长曲线和评估转染细胞的生长速率来测定该蛋白对病毒复制及细胞生长的影响。【结果】多重序列比对显示ADRV-96L存在含Walker A和Walker B基序的AAA-ATPase(ATPases associated with a variety of cellular activities,与各种细胞活性相关的ATPase)结构域(20-159位氨基酸)及两个高度保守的精氨酸。重组原核质粒表达了含ADRV-96L的52 k D融合蛋白,该蛋白质具有ATPase活性(酶的比活性平均为4.68 U/mg)。结果未检出ADRV-96L对病毒的复制影响,但显示该蛋白可促细胞生长。【结论】大鲵蛙病毒96L基因(ADRV-96L)编码一个促细胞增殖和生长的ATPase。
文摘为了进行大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)的早期诊断,以US22家族基因作为靶基因,建立大鲵蛙病毒Taq Man MGB实时荧光定量PCR检测方法,同时对该方法进行特异性、敏感性、重复性评估,并对73份未知大鲵血液样品进行检测。结果显示,标准曲线在所选浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.997;该方法对大鲵蛙病毒的检测有高度特异性,与其他8种病毒或细菌之间均无交叉反应;灵敏性良好,能检测到2.00×101copies/L的标准品浓度,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复的变异系数均小于2%,重复性好;在73份未知样品检测中,Taq Man MGB实时荧光定量PCR能够检测到更低浓度的病毒,较常规PCR的敏感性更佳。鉴于该方法快速、特异、敏感、可重复、可定量的优点,对大鲵蛙病毒早期潜伏感染的快速诊断具有重要意义。
