大麦条纹花叶病毒北京分离物的鉴定

采集北京田间的大麦感病叶片,室内分离病原,血清学检测能够与BSMV新疆株抗血清反应,室内汁液摩擦接种可侵染大麦、小麦、本明烟和苋色藜,能够种子传毒,电镜观察病毒粒子为杆状,同时,国内首次利用RT-PCR扩增出597bp的BSMV外壳蛋白基因.根据以上结果确定分离到的病毒为大麦条纹花叶病毒,其寄主范围和种子带毒率与新疆株系有差别,可能属于不同株系.

大麦条纹花叶病毒中国株CP基因克隆分析、原核表达及抗血清制备

首次用PCR方法，自大麦条纹花叶病毒中国株（BSMV-CH）的RNA2（GenBank登录号为：AY789694，未报道）中扩增出外壳蛋白（coat protein，CP）基因，并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV—CH的CP全长597bp，它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93．1％～93．8％和91．4％-92．4％；与同属的早熟禾半潜病毒（PSLV）和剪秋罗环斑病毒（LRSV）的核苷酸同源性分别为53．0％和41．8％，氨基酸同源性分别为48．1％和40．0％。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树，分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上，优化IFFG诱导终浓度后，在37℃ IFFG终浓度为1．0mmol/L时，融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12％SDS—PAGE表明，表达产物大小为48．5kDa，主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后，用冰冷的KCl显色，分离表达的蛋白质特异条带制备抗原，免疫家兔得到抗血清，酶联法（enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA）测定的抗血清效价为1／6400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测，结果表明抗血清有很高特异性。

大麦条纹花叶病毒诱导大麦cDNA文库的构建

构建病毒诱导的寄主植物cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与病毒相互作用寄主因子的前提条件.该文以大麦条纹花叶病毒接种大麦,在ELISA跟踪检测的病毒复制和运动初期,采集大麦叶片,用TRIZOL法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR获得dscDNA,SfiⅠ/XhoⅠ共切后1.1%琼脂糖凝胶检测并分段回收dscDNA,分别与SfiⅠ/XhoⅠ共切的载体连接后,共同转化X-blue感受态细胞构建文库.文库的容量和质量检测结果表明:文库的容量为1.27×106,插入片段大于500 bp,集中在1.2 kb左右,符合酵母双杂交筛选文库的要求.

大麦条纹花叶病毒中国株基因组RNA1的全长序列分析

【目的】获得大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)基因组RNA1的全长cDNA,进行序列分析,明确与国外报道株系间的亲缘关系和分类地位【。方法】以自然侵染BSMV-CH的大麦叶片中提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法获得BSMV-CH RNA1的全长cDNA,克隆到载体pMD18并测序,用DNAstar软件将获得的序列与GenBank登录的BSMVRNA1序列进行对比,分析各株系序列RNA1之间的同源性,构建系统发育树分析BSMV-CH与国外株系间的亲缘关系。【结果】BSMV-CH的RNA1全长为3795bp(GenBank注册号:AY789693),基因组RNA15′端有一个甲基化的帽子结构,3′端有一个PolyA结构和一段239bp长的类似tRNA的保守序列,BSMV-CH基因组RNA1含有一个长度为3417bp的ORF,推测可编码一个1138个氨基酸的复制酶基因。BSMV-CH的基因组RNA1与国外报道其它株系核苷酸的同源性为95.4%～95.6%。复制酶基因同其它株系核苷酸和氨基酸的同源性分别为94.9%～95.2%和96.5%～96.8%,PolyA的长度比其它株系明显要长。【结论】BSMV-CH和CV42与CV17、ND18、TSE及TSG间的亲缘关系明显低于CV17、ND18、TSG和TSE间的亲缘关系;BSMV-CH与CV42表现相对较近的亲缘关系,但BSMB-CH是不同于CV42的一个BSMV新株系。

微波诱导小麦抗大麦条纹花叶病毒的机制及遗传探索

试验研究表明 ,以 15 %功率比的微波处理携带大麦条纹花叶病毒 (BSMV)的小麦种子 ,能明显提高小麦对BSMV的抗性而增产 ,其诱导机制是提高小麦植株不同部位木质素含量 ,同时提高过氧化物酶的活性 ,减少组织细胞中X体和变异细胞核的数量。由于木质素含量的提高而增强根系对土壤传播病毒禾谷多粘菌的抗入侵、抗扩张能力。上述抗性已知能维持到第 4年。微波处理不能诱导小麦出现突变穗 ,认为微波处理是对小麦细胞质的诱变 ,其抗性机制是细胞质的遗传。

新疆大麦条纹花叶病毒的研究 Ⅱ.病毒核酸cDAN的合成及克隆

本文采用改进的新技术从大麦条纹花叶病毒核酸合成互补脱氧核糖核酸,重组质粒及选择特异性克隆。由于技术的改进,简化了操作程序,提高了工作效率。我们以大麦条纹花叶病毒三个组分核酸混合物为模板,寡(dT)8为引物,合成cDNA第一条链,用Gubler和Hoffman缺口翻译法合成第二条链,采用加HindⅢ人工接头的方法将cDNA插入pUC 9质粒载体上,于大肠杆菌JM-103中进行克隆,并以克隆颜色变化表示有无β-半乳糖苷酶活性的直观法,选择含有外源DNA的克隆。再以克隆原位分子杂交法检查克隆对病毒RNA各组分的特异性。仅对RNA_1或RNA_2有特异性的克隆,分别称为pBV_1和pBV_2,另有相当数量的克隆既与RNA_2也与RNA_3杂交,所以称为pBV2+3。用HindⅢ内切酶对一部分RNA_3杂交阳性的PBV2+3进行分析表明,插入的外源基因长度在500～1,000碱基对之间。文中讨论了RNA_2与RNA_3存在同源的可能性。

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(coat protein,CP)基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus(SBMV)、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus(WSMV)、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus(MCMV)、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus(TRSV)、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus(BPMV)和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus(ToRSV)6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10^(-4) ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。

大麦条纹花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒为禾本科作物上一种重要的病原,可造成严重的经济损失。该病毒的主要传播方式为种传,因此对种子进行检疫监管是控制病害传播的一种有效途径。本文依据病毒保守序列RNA2beta C蛋白设计引物,研发了一种实时荧光RT-PCR检测方法。经特异性与灵敏度评价,仅对大麦条纹花叶病毒有效,无法对小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品进行鉴定;且扩增灵敏度与普通RT-PCR相当,处于0.02 ng/μL水平。该方法相较于已有的检测方法,操作更简便快速,不易污染,灵敏度高,特异性优。此外,本研究结合实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR两种检测方法,对未知谷物粉进行大麦条纹花叶病毒的检测鉴定,证实了新方法的可行性。

大麦条纹花叶病毒中国株编码βC蛋白可以自身相互作用

以分别含有BSMV-CH基因组3个组分ds-cDNA全长的pMD-α、pMD-β和pMD-γ质粒为模板,PCR扩增BSMV-CH编码各蛋白基因,克隆至酵母双杂交载体,检测各蛋白是否存在自身激活特性,用酵母双杂交分析BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用情况,测定β-半乳糖苷酶活性确认蛋白在酵母体内的作用,Western-blot分析蛋白的体外相互作用。结果表明成功克隆到BSMV-CH编码蛋白基因,并正确克隆至酵母双杂交载体,酵母双杂交检测未发现BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用,但确定BSMV-CH编码的βC蛋白可以自身相互作用,体外可以单体或二聚体形式存在。

BSMV-sg系统介导的大麦基因编辑体系的建立

基因编辑元件递送系统是基因编辑技术在大麦中广泛应用的制约因素之一,建立无需遗传转化的基因编辑元件递送系统,对于进一步提高大麦基因编辑技术的利用效率,加快大麦育种进程具有重要意义。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)作为八氢番茄红素脱氢酶基因PDS的sgRNA的递送系统,侵染烟草并接种大麦Cas9过表达株系的叶片,分析了大麦叶片中BSMV的侵染效果和PDS基因的编辑效率。结果表明,接种大麦植株的主茎新生叶片和分蘖叶片均含有BSMV,BSMV-sg能够在大麦体内复制并移动。接种大麦植株的主茎新生叶片和分蘖叶片呈现不同程度的白化表型,15份叶片的PDS基因在靶点区域存在着1个或多个变异,包括碱基的插入、缺失或替换,为体细胞编辑,第3分蘖具有更高比例的PDS等位变异。在150个M1子代植株中,筛选到1株纯合编辑植株。本研究在大麦中建立了基于BSMV的可遗传的基因编辑系统,为大麦基因组编辑提供了一种方便、高效的方法。

在小麦上实施基因沉默的VIGS系统优化

以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)改造的VIGS(Virus induced gene silencing)载体在单子叶植物中能够介导基因沉默,因此BSMV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。本试验通过在近等基因系TcLr24中对BSMV VIGS载体系统进行优化,以保证更方便地在小麦近等基因系(NIL)中实施VIGS功能验证。

利用BSMVAgro/LIC进行小麦条锈菌耐高温相关基因功能分析的互作体系构建

为利用HIGS技术研究条锈菌耐高温胁迫相关基因的功能,需要构建小麦品种与条锈菌及大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)亲和互作体系。本研究选用20个常温下(10℃)高感条锈病的小麦品种和22个耐高温条锈菌菌株,进行高温(21℃)条件下接种亲和性分析,发现11个品种高感条锈病、3个菌株耐高温性稳定且毒性谱较宽。在此基础上,利用含有小麦TaPDS基因片段的重组BSMV侵染上述候选小麦品种,确定‘Local Red'等6个品种与BSMV亲和程度符合试验要求。筛选出小麦品种‘Local Red'与菌株15335-2、15323-4等组成的最佳互作组合,适合利用BSMV Agro/LIC方法开展小麦条锈菌耐高温相关基因功能的研究。

基于小麦品种‘洛夫林10’的VIGS体系研究

为将病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技术应用于小麦-叶锈菌互作体系及小麦基因功能研究,本试验在优化适宜BSMV繁殖并引起发病的环境条件基础上,将病毒载体转染小麦品种‘洛夫林10’(简称L10)叶片并接种叶锈菌生理小种,发现接种病毒对叶锈菌侵染反应型没有影响,通过构建TaCAMTA4与TaATG8的BSMV-VIGS载体,将体外转录病毒转染小麦,以感染BSMV:PDS的L10作指示,在指示叶片变白后,经半定量RT-PCR检测,发现目的基因的表达量明显降低,表明用VIGS技术能够成功沉默L10中的目的基因,这一结果为进一步研究小麦与叶锈菌互作过程中小麦基因的功能及分子机制奠定了基础。

TaERFL1a转录因子在小麦籽粒淀粉合成中的功能研究

乙烯响应转录因子(AP2/ERF)家族在植物逆境胁迫与物质合成中有重要功能,其成员TaERFL1a参与了小麦响应非生物胁迫过程,然而其在淀粉合成中的功能尚不清楚。本研究利用大麦条纹花叶病介导的基因沉默技术(barley stripe mosaic virus-virus induced gene-silencing,BSMV-VIGS),在田间条件下抑制TaERFL1a基因在小麦籽粒中的表达,通过测定灌浆期间籽粒内该基因的表达量、成熟籽粒产量性状和淀粉性状,探究TaERFL1a在小麦籽粒淀粉合成中的功能。结果发现,在接种后23 d,接种BSMV-VIGS-TaERFL1a植株籽粒内TaERFL1a基因表达水平降低了86.5%;TaERFL1a基因沉默植株成熟籽粒的粒长、粒宽、千粒重和淀粉含量分别降低了5.22%、12.70%、9.53%和5.43%;TaERFL1a基因沉默植株的籽粒淀粉粒排列疏松且数量减少。这些结果表明TaERFL1a转录因子在小麦灌浆期间的籽粒淀粉合成中发挥了重要作用。

病毒病害

参见 W94:2115W942086 埃及大麦上大麦黄矮病毒的发生[会,英]/Ghobrial,E.…∥Barley yellow dwarf in WestAsia and North Africa.Proceedings of a workshopheld at Rabat,Morocco,19～21 November 1989/Comeau,A.….-Aleppo,Syria:International Centrefor Agricultural Research in the Dry Areas,1992.-103～107[WBTA,1993,10(2),1619]W942087 德国萨尔州大麦黄矮病毒的发生[刊,

钙依赖性蛋白激酶34在小麦籽粒淀粉合成的功能

钙依赖性蛋白激酶在调控植物发育与物质合成中发挥重要功能。为探讨一个钙依赖性蛋白激酶-TaCPK34在小麦淀粉合成中的功能,利用大麦条纹花叶病介导的基因沉默技术(barley stripe mosaic virus-virus induced gene-silencing,BSMV-VIGS)将该基因沉默,并在田间条件下测定灌浆期间沉默植株籽粒内TaCPK34基因的表达量及成熟籽粒的淀粉性状。结果表明,在花后15 d、20 d、26 d和30 d,BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株中TaCPK34基因表达量受到显著抑制(63.8%～97.8%); BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒淀粉含量、千粒重、粒长和粒宽均显著降低(降幅分别为6.0%、7.1%、4.4%和11.0%);扫描电镜观察发现BSMVVIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒内淀粉粒排列疏松且数量减少。这些研究结果表明TaCPK34在小麦籽粒灌浆期间对籽粒淀粉的合成有重要影响。