大麦黄条点花叶病毒的分布及其分离物的遗传多样性

【目的】明确大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)在中国北方小麦主产区的分布及其种群遗传多样性,为病害流行预警和防控提供理论依据。【方法】2008—2016年,在河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等7个省66个县/市/区田间,采集了864份疑似病毒病症状的植物样品。提取样品总RNA,利用一步法三重RT-PCR技术检测样品中的BYSMV、水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和北方禾谷花叶病毒(Northern cereal mosaic virus,NCMV)。利用RT-PCR扩增获得BYSMV的L和N基因片段,克隆并测定核苷酸序列,应用MEGA、Dna SP和PAML等软件分析BYSMV分离物的系统进化和遗传多样性特征。【结果】从48个县/市/区采集的336份样品中检测到BYSMV,检出率为38.89%,该病毒主要分布于陕西、河北、山西和山东,另外,河南及安徽北部亦有分布,江苏徐州和邳州仅局部发生。基于BYSMV的L、N基因序列构建的系统发育树均可将分离物划分为2个亚组,亚组I中的分离物其来源涉及全部7个省份,而亚组II中的分离物仅来自陕西和山西2个省,基于L基因序列系统发育分析表明亚组II分离物与伊朗的分离物亲缘关系较近,BYSMV的遗传分化与分离物的地理来源相关,而与寄主植物、发生时间无明显相关性。运用RDP程序包的7个软件进行基因重组分析显示没有支持重组的证据。选择压力分析显示,亚组内和亚组间的ω(d N/d S)值(0.02—0.19)远小于1,表明群体正承受净化选择。L和N基因的单倍型多样性(Hd)值(0.90909和0.99524)均大于0.5、核苷酸多样性(π)值(0.01324和0.01224)均高于0.005,表明中国BYSMV群体遗传多样性丰富。基于L和N基因片段的遗传分化研究显示,东部和西部群体的遗传分化系数(FST)值(0.32201和0.37326)均大于0.25,且统计检验差异显著,表明东部和西部的BYSMV群体严重分化;基因流(Nm)值(0.53和0.42)均小于1,说明有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原因。【结论】BYSMV在中国北方小麦主产区分布广泛,河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等地均有不同程度的发生。BYSMV群体具有丰富的遗传多样性,且东部和西部群体之间存在严重的遗传分化。

大麦黄条点花叶病毒传播方式和传播特性研究初报

大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)是我国小麦产区新发现的一种病毒,为了明确该病毒的发生流行规律并建立相应的防治方法,在温室条件下对该病毒的传播方式、介体传毒特性进行了研究。初步研究结果表明:BYSMV仅由介体昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)传播,不能通过机械摩擦、土壤和病残体传播。该病毒在灰飞虱体内的循回期最短为6 d,接种后20 d达到传毒发病盛期。灰飞虱最短获毒和传毒时间均为1 min,病毒在小麦苗中的最短潜育期为5 d。由此可见,灰飞虱对BYSMV具有较强的获毒和传毒能力。本研究为下一步进行该病毒的寄主范围、病害的发生规律等方面的研究提供了技术手段,也为生产上预防和控治由该病毒引起的病害提供了理论依据。

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱c DNA文库进行了筛选。将BYSMV N基因构建到诱饵载体p DHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体p DHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选p PR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱c DNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。

灰飞虱传播的一种小麦病毒病鉴定

在实验室中利用灰飞虱接种小麦时出现一种新的病毒病症状，鉴定表明其病原为大麦黄条点花叶病毒（Barleyyellowstriatemosaicvirus，BYSMV）。采用生物学测定、电镜观察、RT—PCR检测和序列分析的方法，明确了该病毒的粒体特性、危害症状及田间发生情况。接种试验表明该病毒通过灰飞虱传播，接种7-10d后小麦新生叶片出现黄色斑点、斑驳，继而发展成黄色条纹，叶片对生且细而窄，重病株新叶扭曲，叶鞘不能伸长，病株矮化。对小麦病叶超薄切片电镜观察，发现细胞质中存在大量弹状病毒粒子，病毒粒体大小为（315—353）mm×（46～57）nm。利用特异性引物从病株总RNA中扩增出565bp基因片段，序列同源性分析显示与大麦黄条点花叶病毒（Barleyyellowstriatemosaicvirus，BYSMV）Zanjan-1分离物聚合酶（L）基因对应序列的一致性为97％，与北方禾谷花叶病毒（Northerncerealmosaicvirus，NCMV）L基因对应序列的一致性为78％～79％。对采自河北邯郸、石家庄、保定、唐山的31株样品进行RT—PCR检测，25株检测到BYSMV，7株检测到水稻黑条矮缩病毒（Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV），其中5株为2种病毒复合侵染，结果表明BYSMV的田间分布较广。系统发育分析表明BYSMV—Lab／TS／ZX／QY4个分离物与本研究的BYSMV亲缘关系密切。BYSMV是我国小麦上新发现的一种弹状病毒，并已形成危害，暂定名为小麦黄条纹矮缩病，应加强流行动态监测。