类视黄醇X受体对缺氧/复氧诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激反应的调控作用

目的:探讨类视黄醇X受体(RXR)在缺氧/复氧(HR)诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)氧化应激反应中的调控作用。方法:随机将细胞实验分成5组:对照(C)组、HR组、HR+溶剂二甲基亚砜(DMSO)组(HD组)、HR+RXR激动剂9-顺式维甲酸(9-RA)组(RA组)和HR+RXR抑制剂HX531组(HX组)。采用CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光法进行AECⅡ特异性指标表面活性物质蛋白A(SP-A)的鉴定和RXRα表达的观察;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;透射电镜观察细胞内超微结构的变化;Western blot检测核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白水平;RT-PCR检测Nrf2的mRNA表达水平。结果:与C组相比,HR、HD、RA和HX组细胞活力均显著降低(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量显著增高(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01);与HR和HX组相比,RA组细胞活力增加(P<0.05),SOD活性上升(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01)。结论:HR可加剧大鼠AECⅡ的氧化应激反应,RXR激动剂干预后可通过抑制氧化应激反应减轻HR引起的大鼠AECⅡ损伤。

甲状腺激素T3抑制内质网应激保护大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞和减轻大鼠低氧性肺损伤

目的:探讨甲状腺激素能否减轻高原低氧环境中大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞与肺组织损伤,并探寻其作用机制。方法:将20只SPF级别、8周周龄的雄性SD大鼠分为正常对照组与高原模型组,每组10只。高原模型大鼠置于模拟海拔6 000 m低氧环境的模拟舱内构建高原低氧模型,正常对照组大鼠生活海拔与当地一致。造模结束后在正常海拔下收集两组动物血清与肺组织。电镜和TUNEL染色法观察大鼠肺组织细胞凋亡情况,使用RT-qPCR与Western blot检测大鼠肺组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和转录激活因子6(ATF6)mRNA与蛋白表达。甲状腺滤泡上皮细胞分为常氧组与低氧组。常氧组正常条件培养,低氧组缺氧培养24 h,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率,用ELISA法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)、甲状腺激素T3和T4含量。大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分为常氧组、常氧+甲状腺激素(T3)组、低氧组和低氧+T3组,按组别加入T3后进行缺氧处理,CCK-8法检测细胞增殖率,细胞染色观察活死细胞比例,ELISA检测细胞LDH含量,TUNEL染色观察细胞凋亡,RT-qPCR与Western blot法检测Ⅱ型肺泡上皮细胞中GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA与蛋白表达,免疫荧光法对细胞GRP78、ATF6和Bax进行共定位检测。结果:高原组大鼠肺组织凋亡细胞增加,GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA与蛋白表达水平显著升高(P<0.01);甲状腺细胞缺氧培养后细胞增殖率与T3、T4含量降低,LDH含量显著升高(P<0.01);与低氧组相比,低氧+T3组Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖率显著升高,凋亡率与LDH含量显著降低,GRP78、IRE1α、PERK和ATF6的mRNA与蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:外源性甲状腺激素可以减轻大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞低氧性损伤,其机制可能与抑制肺泡上皮细胞中内质网应激通路相关基因表达有关。

沉默调节蛋白1对脂多糖诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的 探讨沉默调节蛋白1(SIRT1)在脂多糖(LPS)诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤中的作用及机制。方法 分离大鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,并分为对照组、模型组和实验组。模型组和实验组分别用空白和SIRT1 shRNA慢病毒感染后,再加入LPS诱导细胞损伤。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和Western blot检测SIRT1的表达;采用CCK-8实验检测细胞活力;采用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达;采用JC-1染色法检测线粒体膜电位;采用化学显色法检测细胞丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与对照组相比,模型组Ⅱ型肺泡上皮细胞SIRT1 mRNA和蛋白表达水平升高,细胞活力下降,促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平和分泌水平升高,线粒体膜电位下降,MDA水平升高,SOD活性下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,实验组Ⅱ型肺泡上皮细胞SIRT1 mRNA和蛋白表达水平下降,细胞活力升高,促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平和分泌水平下降,线粒体膜电位升高,MDA水平下降,SOD活性升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SIRT1通过影响线粒体活性和细胞氧化还原稳态促进LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤。

高氧对早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化的影响

目的:探讨高氧对早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeIIalveolarepithelialcells,AECⅡ)转分化的影响。方法:原代培养早产大鼠的AECⅡ,建立高氧细胞损伤模型。利用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞的形态变化。用免疫细胞化学染色法检测AECⅡ特异性肺泡表面活性蛋白-C(surfactantproteinC,SP-C)及Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠalveolarepitheli-alcells,AECⅠ)特异性水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)的表达。用RT-PCR和流式细胞术分别检测SP-C、AQP5mRNA及蛋白的表达。结果:随着给氧时间的延长,原代培养的AECⅡ伸展变平,失去其板层体及微绒毛,丧失AECⅡ的特性,获得AECⅠ样外观。伴随其形态学改变,AECⅡ逐渐停止表达其特异性蛋白SP-C,开始表达AECⅠ特异性蛋白AQP5。高氧组给O2后24、48及72h,SP-CmRNA、SP-C+细胞的表达率及荧光指数(fluorescenceindex,FI)较同时间点的空气组明显降低,AQP5的上述指标在24h和48h则较空气组明显增加。高氧组给O2后72h,AQP5的表达开始减弱,与同时间点的空气组相比较无明显差异。结论:高氧诱导的早产大鼠AECⅡ转分化在肺泡上皮细胞损伤的修复中起重要作用。

慢性阻塞性肺疾病大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡水平的变化及吸入糖皮质激素对其的影响

目的研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)凋亡水平的变化,探讨AECⅡ凋亡在COPD发病机制中的作用及吸入糖皮质激素的影响。方法气管内注入脂多糖联合香烟烟熏法建立COPD动物模型,雾化吸入布地奈德(BUD)混悬液进行干预。将48只大鼠随机分为8组:空白对照组、BUD对照组、COPD15d组、低剂量BUD干预15d组、高剂量BUD干预15d组、COPD30d组、低剂量BUD干预30d组、高剂量BUD干预30d组。各组大鼠分别于第15或30d处死。肺组织切片用HE染色观察肺泡破坏程度,用免疫组化法和TUNEL法观察AECⅡ凋亡情况。结果(1)不同时点COPD组大鼠肺泡结构破坏程度、AECⅡ凋亡水平显著高于空白对照组和BUD对照组(P均<0.01),且呈时间依赖性趋势;AECⅡ凋亡水平和肺泡结构破坏程度之间呈显著正相关(免疫组化法:r=0.92,P<0.01;TUNEL法:r=0.90,P<0.01)。(2)BUD可显著降低肺泡结构破坏程度(P<0.01)及AECⅡ凋亡水平(P<0.01),且呈剂量依赖性趋势。结论AECⅡ凋亡可能通过参与肺泡结构破坏的方式参与了COPD的形成。吸入性糖皮质激素可显著降低肺泡破坏程度和AECⅡ凋亡水平,为其用于COPD的治疗提供了实验依据。

磷脂酶A_2对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞NF-κB表达的影响

目的:研究磷脂酶A(2PLA2)及含有PLA2的急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)大鼠血清对原代大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤作用及对NF-κB表达的影响。方法:对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞进行分离纯化和原代培养,分别加入PLA2及含有PLA2的AHNP大鼠血清,并设PLA2抑制剂对照组,各组均孵育4h,离心收集细胞,破碎细胞核提取核蛋白,ELISA法测定NF-κB活性;测定培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,对培养细胞进行透射电镜检查。结果:PLA2及AHNP大鼠血清可使Ⅱ型肺泡上皮细胞培养上清液中LDH活性及Ⅱ型肺泡上皮细胞NF-κB活性显著增高,透射电镜检查显示Ⅱ型肺泡上皮细胞受损严重。盐酸阿的平可显著抑制PLA2对Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤作用,降低LDH活性,抑制NF-κB的表达。结论:PLA2对Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤作用是造成胰腺炎肺损伤的重要因素,还与其激活NF-κB的表达有关。

博莱霉素致肺纤维化大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡

目的研究博莱霉素(BLM)对肺纤维化大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)凋亡的影响及其可能机制。方法32只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=8)和BLM组(n=24),分别给予BLM组和假手术组大鼠气管内一次性注入5mg/kgBLM和等量生理盐水。于给药后1、3、7d随机取BLM组大鼠8只,给药后7d取假手术组大鼠进行ATⅡ分离和纯化。采用流式细胞术进行细胞周期、细胞凋亡率、细胞内游离Ca2+浓度、线粒体跨膜电位(MMP)检测;免疫细胞化学法检测ATⅡBax、Bcl-2和Fas的表达;比色法测定ATⅡCaspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。结果BLM组ATⅡS期细胞比率显著低于假手术组(P<0.05)。BLM组1和3d时ATⅡ的凋亡率显著高于假手术组(P<0.01)。BLM组1、3和7d时ATⅡ内游离Ca2+浓度显著高于假手术组(P<0.05),MMP显著低于假手术组(P<0.05)。BLM组1、3和7d时ATⅡBax和Fas染色阳性率和Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性均显著高于假手术组(P<0.05,P<0.01)。BLM组1和3d时ATⅡBcl-2染色阳性率显著低于假手术组(P<0.05)。结论BLM在ATⅡ损伤早期可能通过升高细胞内Ca2+浓度,激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,降低MMP,诱导Fas、Bax高表达,促使ATⅡ凋亡,引发肺纤维化。

白介素-15对过氧化氢诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的观察白介素-15(IL-15)对H2O2诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响及探讨其机制。方法体外培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN),分为:(A)正常对照组;(B)IL-15预处理组;(C)H2O2损伤组;(D)IL-15预处理后H2O2损伤组。采用DAPI荧光染色及Annexin V-FITC/PI检测各组细胞凋亡,JC-1染色观察各组线粒体膜电位;RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达。结果与正常对照组比较,H2O2损伤能明显诱导RLE-6TN凋亡,IL-15预处理可明显降低H2O2诱导的细胞凋亡率,使细胞线粒体膜电位下降,Bcl-2 mRNA表达增加,Bax、Caspase-3mRNA表达降低(P<0.05)。结论 IL-15能抑制H2O2诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡,其作用机制可能为稳定细胞线粒体膜电位,增强抗凋亡基因Bcl-2,同时,抑制促凋亡基因Bax表达,下调Caspase-3表达。

神经肽P物质对早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的调控作用

目的探讨高氧对离体培养的早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)的影响及感觉神经肽P物质(SP)的保护作用及其与p38蛋白激酶(p38MAPK)信号转导机制的关系。方法分离纯化原代早产鼠AECⅡ,随机分为空气暴露组、高氧暴露组、SP干预空气暴露组及SP干预高氧暴露组。空气暴露组氧体积分数为0.21(21%),高氧暴露组氧体积分数为0.95(95%),SP干预组于暴露前加入SP1×10-6mol/L,在置于氧体积分数为0.21(21%)和0.95(95%)中各组分别暴露12、24、和48h,电镜观察AECⅡ的形态变化;MTT法及流式细胞仪测定其增殖率和凋亡率;蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测磷酸p38MAPK的动态变化。结果与空气暴露组比较,高氧组暴露12、24、48h后AECⅡ增殖率明显降低,凋亡率明显增加,而SP干预后其增殖率明显增加,凋亡率明显下降,形态学的损伤也有明显的改善。高氧刺激可导致p38的磷酸化激活,磷酸化p38在高氧损伤的AECⅡ表达明显增加,SP干预后,磷酸化p38表达明显降低。结论 P物质可促进高氧暴露AECⅡ的增殖并抑制AECⅡ的凋亡,SP通过抑制p38MAPK信号激活对氧化应激状态下的AECⅡ细胞可起到保护作用。

维生素C对低硒高镉饲料饲养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞DNA的影响

目的探讨维生素C对低硒高镉饲料饲养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)的影响。方法将72只Wistar大鼠随机分为8组(每组9只):普通饲料对照组(C1组),实验构成饲料对照组(C2组),低硒+高镉组(第1组),低硒+高镉+维生素C组(第2组),适量硒+高镉组(第3组),适量硒+高镉+维生素C组(第4组),高硒+高镉组(第5组),高硒+高镉+维生素C组(第6组)。采用单细胞凝胶电泳技术分别观察各组动物饲养14周后AT-Ⅱ细胞DNA的改变。结果大鼠AT-Ⅱ细胞DNA损伤率分别为:C1组9.00%,C2组9.20%,第1组34.20%,第2组18.60%,第3组19.00%,第4组14.40%,第5组13.80%,第6组9.40%。第6组大鼠AT-Ⅱ细胞DNA损伤率与C1组和C2组无显著差异(P均>0.05)。第4组和第5组AT-Ⅱ细胞DNA损伤程度较轻。第2组和第3组大鼠AT-Ⅱ细胞的DNA损伤较重。第1组大鼠肺细胞的DNA损伤最为严重(P<0.01)。结论低硒并高镉可在一定程度上改变AT-Ⅱ细胞的DNA生物学特性,维生素C可以对抗低硒并高镉对AT-Ⅱ细胞所致的这种变化。

氨溴索对铜绿假单胞菌肺炎大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞超微结构的影响

目的 :研究铜绿假单胞菌 (PA)肺炎大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的超微结构变化 ,并观察盐酸氨溴索对上述变化的影响。方法 :将 30只雄性SD大鼠随机平均分为 3组 :感染组 ,气管内注射 2个麦氏单位PA标准菌株ATCC2 785 3菌液 0 .2ml,建立PA肺炎大鼠模型 ;治疗组 ,气管内注射菌液 6h后给以盐酸氨溴索 2 0mg/kg静脉注射 ;对照组 ,经气管注射等量生理盐水。 6h后处死大鼠 ,观察右肺组织病理学变化 ,并作中性粒细胞 (PMN)计数。结果 :受感染大鼠大体标本和病理切片均显示典型的感染征象。湿 /干比值分别为 :感染组 8.5 8± 0 .39,治疗组 7.4 7± 0 .2 2 ,对照组 4 .4 8± 0 .15 (P <0 .0 5 )。计数分别为 :感染组(111.4± 14 .8) ,治疗组 (38.3± 3.11) ,对照组 (4 .4± 2 .6 )个 /高倍视野 (P <0 .0 5 )。肺组织电镜观察 ,治疗组见肺泡Ⅱ型上皮细胞内的板层体空泡化较对照组减轻 ,肺泡表面的表面活性物质层分布较均匀 ,未见明显断裂。结论 :PA肺炎大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内的板层体及肺泡表面活性物质层受到损害。氨溴索治疗可部分减轻肺表面活性物质系统的损害。

甘草酸二铵对百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌TGF-β1的影响

目的探讨甘草酸二铵(DG)对百草枯(PQ)刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响。方法采用不同浓度的PQ溶液(200、400、600、800、1 000、1 500、2 000μmol/L)诱导大鼠AECⅡ24 h,测定PQ对AECⅡ生存率的影响,了解IC50的PQ浓度。在1 000μmol/L PQ诱导下,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL浓度DG干预AECⅡ24 h,测定细胞生存率,了解DG干预PQ诱导下AECⅡ最高生存率的DG浓度。再将AECⅡ分为3组,空白组、PQ组(以1 000μmol/L PQ培养24 h)、DG组(先以0.6 mg/m L DG培养2 h,再以0.6 mg/m L DG+1 000μmol/L PQ培养24 h)。倒置显微镜观察AECⅡ的形态及生长情况;酶联免疫吸附法测TGF-β1含量;实时荧光RT-PCR测定TGF-β1 m RNA表达。结果 IC50的PQ浓度为920.87μmol/L,在1 000μmol/L PQ诱导下,以0.6 mg/mL浓度DG干预AECⅡ24 h生存率最高。与空白组比较,PQ组TGF-β1水平及其m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与PQ组比较,DG组TGF-β1量及其m RNA的表达明显下降,差异有显著性(P<0.05)。结论本实验成功建立了合适的PQ损伤大鼠II型肺泡上皮细胞的模型及DG干预模型。PQ促进AECⅡ分泌TGF-β1,甘草酸二铵可以降低PQ诱导下AECⅡ分泌TGF-β1水平。

细胞自噬在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞低氧/复氧损伤中的作用

目的探讨细胞自噬在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)低氧/复氧(H/R)中的作用。方法将大鼠AECⅡ分为对照组(C)、低氧/复氧组(H/R)、DMSO溶剂组(HD)、自噬激动剂组(Rap)和自噬抑制剂组(3-MA)。CCK-8法检测细胞活力;反转录RT-PCR检测自噬相关蛋白mRNA表达水平;Western blot检测自噬相关蛋白水平;透射电镜检测细胞超微结构。结果与对照组相比,H/R组细胞活力均有下降,自噬相关蛋白及mRNA表达水平均上调(P<0.05),细胞超微结构损伤较严重;与H/R组相比,3-MA组的细胞活力较高,自噬相关蛋白及mRNA表达水平均下调(P<0.05)。结论低氧/复氧可激活细胞自噬引发大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤。

高氧导致20S蛋白酶体活性降低诱导早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡

目的建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)原代培养高氧细胞损伤模型,研究高氧对泛素化蛋白的降解及AECⅡ凋亡的影响。方法早产大鼠原代AECⅡ体外培养,利用950 m L/L O2建立高氧细胞损伤模型并随机分为空气组和高氧组。空气或高氧暴露24、48、72 h后,采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR检测泛素mRNA表达,Western blot法检测细胞内总泛素化蛋白及凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达,利用特异性荧光底物检测20S蛋白酶体活性。结果与同时间点空气组相比,各时间点高氧组AECⅡ凋亡增加,AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素mRNA和总泛素化蛋白表达增加,同时Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达明显上调。结论高氧暴露引起AECⅡ中20S蛋白酶体活性降低,泛素化蛋白降解减少,通过上调Bax/Bcl-2比值和caspase-3表达诱导AECⅡ凋亡。

胍丁胺对高氧性急性肺损伤大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的观察胍丁胺对高氧性急性肺损伤(HALI)大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)凋亡的影响,为HALI的药物治疗提供基础理论依据.方法按随机数字表法将24只健康SD大鼠分为正常对照组(在空气中饲养)、HALI模型组、胍丁胺预处理组(高氧处理前给予400 mg/kg的胍丁胺),每组8只.将大鼠置于氧浓度>90%,温度25~27 ℃,湿度50%~70%,二氧化碳(CO2)浓度<0.5%的自制高氧模型箱中复制HALI大鼠模型;正常对照组不进行任何处理.高氧处理48 h后取大鼠颈动脉血进行血气分析;光镜下观察肺组织病理学改变并进行评分;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-1)含量;采用流式细胞仪检测肺组织AECⅡ凋亡情况,并计算细胞凋亡率;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平.结果与正常对照组比较,HALI模型组氧合指数(OI)、Bcl-2蛋白表达明显降低〔OI(mmHg,1mmHg=0.133 kPa):135.04±16.82比463.74±22.04,Bcl-2蛋白表达(A值):0.35±0.18比0.89±0.08,均P<0.05〕,而呼吸指数(RI)、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1、AECⅡ凋亡率、Bax蛋白表达均明显升高〔RI :1.29±0.15比0.24±0.03,肺组织病理学评分(分):4.72±1.32比0,TNF-α(μg/L):44.48±1.42比14.12±0.88,IL-6(μg/L):51.46±1.62比23.20±0.89,IL-1(μg/L):44.03±2.45 比 11.64±1.34,AEC Ⅱ 凋 亡 率:(56.24±1.14)% 比(22.64±0.58)%, Bax蛋白表达(A值):2.37±0.34比1.41±0.48,均P<0.05〕.与HALI模型组比较,胍丁胺预处理组大鼠OI、Bcl-2蛋白表达明显升高〔OI(mmHg): 364.72±14.56比135.04±16.82,Bcl-2蛋白表达(A值):0.68±0.10比0.35±0.18,均P<0.05〕;而RI、肺组织病理学评分、TNF-α、IL-6、IL-1、AECⅡ凋亡率、Bax蛋白表达均明显降低〔RI : 0.45±0.09比1.29±0.15,肺组织病理学评分(分):2.30±0.96比4.72±1.32,TNF-α(μg/L):22.98±0.72比44.48±1.42,IL-6(μg/L):35.79±0.86比51.46±1.62,IL-1(μg/L):24.06±0.86比44.03±2.45, AECⅡ凋亡率:(28.58±1.21)%比(56.24±1.14)%,Bax蛋白表达(A值):1.98±0.42比2.37±0.34,均P<0.05〕.结论胍丁胺可降低HALI大鼠AECⅡ凋亡率,其机制有待进一步研究.

烟草提取液对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞TGF-1β/smad2信号通路表达的影响及机制研究

香烟烟雾(CS)是导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)进展的主要危险因素,目前尚无有效的治疗方法来抑制该病的进展;同时,也有研究表明吸烟能够引起肺纤维化。本实验主要研究烟草提取液对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ)的影响及对其转化生长因子-β1/smad2(TGF-1β)信号通路的影响,并探讨其可能的作用机制。大鼠ATⅡ经4%烟草提取物处理后,TUNEL assay检测到大鼠ATⅡ数量减少并存在明显的凋亡小体,同时Western blot检测发现,TGF-1β蛋白表达量明显增多,p-Smad2蛋白表达量也出现了显著的变化。烟草提取物能够促进ATⅡ的凋亡,并且激活TGF-1β/smad2信号通路,本研究从TGF-1β/smad2信号通路的激活阐释了烟草提取物对ATⅡ损伤的可能机制,为以后的研究奠定了一定的基础。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

人羊膜间充质干细胞对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子影响的研究

背景烟雾吸入性肺损伤在烧伤患者中较为常见,吸入的有毒气体、颗粒等易引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI),目前无特异性治疗方法。目的研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT-Ⅱ)增殖、凋亡及炎症因子的影响。方法采用酶消化法分离培养hAMSCs和AT-Ⅱ,采用流式细胞术和免疫荧光分别鉴定hAMSCs和AT-Ⅱ;松木屑烟雾溶液染毒AT-Ⅱ复制烟雾诱导的细胞损伤。实验细胞分为对照组(无血清DMEM/F12)、致伤组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒)和治疗组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒,hAMSCs与AT-Ⅱ共培养)。采用CCK-8检测细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;Elisa检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的表达。结果与对照组比较,致伤组AT-Ⅱ的活性降低(P<0.01),经hAMSCs治疗后,与致伤组比较,AT-Ⅱ细胞活性增加(P<0.01);致伤组细胞的凋亡率在12 h和24 h均增加(P<0.01),hAMSCs治疗后细胞凋亡率降低(P<0.01);细胞致伤后炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量增加(P<0.05),经hAMSCs共培养12 h和24 h后,促炎因子TNF-α和IL-6的表达均下调(P<0.05),IL-10含量增加(P<0.05)。结论hAMSCs可以促进松木屑烟雾溶液诱导的AT-Ⅱ增殖和抑制细胞凋亡,可能与调节炎症因子的表达有关,为探究hAMSCs治疗烟雾引起的急性肺损伤提供理论依据。

膜联蛋白A1拟肽AC2-26调控ERK/NF-κB信号通路改善体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤

目的探究AC2-26对体外循环(CPB)血清诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响及其作用机制。方法收集16例风湿性心脏病手术患者CPB停机后的无菌血液并分离血清,建立体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型。提取健康SD大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞,培养72 h后,随机分为5组即对照组(C组),肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)损伤组(M组),AC2-26+AECⅡ损伤组(A组),AECⅡ损伤+Boc2组(B组),AC2-26+AECⅡ损伤+Boc2组(A+B组)。CCK-8、流式细胞术检测各组细胞增殖、凋亡情况;免疫荧光检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞甲酰肽受体2(FPR2)和肺泡表明活性物质(SPC)表达情况;透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体的影响;Western blot检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞ERK、NF-κB表达情况。结果应用AC2-26后,CPB血清诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖率明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05),AC2-26明显抑制ERK及NF-κB蛋白的磷酸化(P<0.05),促进SPC的表达,改善细胞内板层小体结构及形态,这一现象可被甲酰肽受体抑制剂Boc2阻断。结论AC2-26可以减轻CPB血清诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤,其作用机制可能与FPR2调节ERK、NF-κB信号通路有关。

脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。