SIRT1激动剂促进老化内皮细胞增殖和成血管能力

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶1(silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)抑制剂EX-527与激动剂SRT1720对老化内皮细胞成血管能力的影响。方法采用体外培养大鼠原代主动脉内皮细胞衰老技术,通过培养细胞的自然倍增建立大鼠主动脉内皮细胞(rat aorta endothelial cell,RAEC)衰老的细胞模型。内皮细胞的衰老用SA-β-Gal染色进行鉴定。衰老细胞模型建立后,对衰老的RAEC分别给予SIRT1抑制剂EX527和SIRT1激动剂SRT1720干预。运用Ki-67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖,采用基质胶内皮管形成实验检测内皮细胞内皮管形成,应用蛋白印迹技术检测内皮细胞eNOS表达。结果SIRT1激动剂抑制老化RAEC增殖能力、内皮管形成能力和eNOS表达的降低,而SIRT1抑制剂使老化RAEC的增殖能力、内皮管形成能力和eNOS表达降低。结论SIRT1促进RAEC的增殖和内皮管形成,并增强RAEC中eNOS的表达;SIRT1改善衰老内皮细胞受损的成血管能力可能与其抑制衰老RAEC eNOS表达的下调有关。

原代大鼠主动脉内皮细胞衰老模型的建立

目的建立血管衰老模型,观察比较高葡萄糖(HG)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、过氧化氢(H_2O_2)及棕榈酸(PA)对原代大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)诱导衰老作用。方法取2月龄雄性Wistar大鼠,组织贴块法提取原代RAEC并采用免疫荧光细胞化学染色检测CD31的表达并进行鉴定。分别应用30 mmol/L葡萄糖(HG)、 10μmol/L AngⅡ、 100μmol/L H_2O_2、 0.5 mmol/L PA处理原代RAEC 24 h。采用β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老情况,实时荧光定量PCR检测衰老相关基因P16 mRNA的水平, Western blot法检测衰老相关基因P16、 P21、 P53蛋白水平;免疫荧光细胞化学染色观察P16的表达, CCK-8法观察细胞存活率。结果与对照组相比,各处理组RAEC中β-半乳糖苷酶染色细胞增加,以H_2O_2、 PA处理组更明显; HG、 AngⅡ、 H_2O_2、 PA处理均可增加RAEC的P16 mRNA水平; AngⅡ、 H_2O_2、 PA处理均可增强RAEC的P16、 P21蛋白水平,以H_2O_2组最显著。各处理组细胞P16表达均增强,与对照组相比, HG组与AngⅡ组细胞存活率变化不大, H_2O_2组与PA组细胞存活率显著降低。结论 HG、 AngⅡ、 H_2O_2及PA均可诱导建立RAEC衰老模型,以H_2O_2诱导衰老作用最强。

大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养和纯化鉴定

目的探索分离、培养大鼠胸主动脉血管内皮细胞的有效方法。方法取Wistar大鼠1只,无菌条件下打开胸腔取出胸主动脉,去除外周结缔组织及脂肪,使主动脉内膜翻出,用丝线结扎动脉两端后用烧热的镊子烫烙。置于50ml铺有鼠尾胶培养瓶中培养,加入含有20%新生牛血清的DMEM/F12培养液静止培养,6d后换液并弃主动脉。经0.125%胰酶差速消化传代,采用免疫细胞化学法鉴定血管内皮细胞标志分子Ⅷ因子在细胞中的表达情况。结果培养6d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长;12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶底,约70%的细胞汇合成单层;经胰酶差速消化传代细胞生长旺盛,细胞汇合后呈现典型的"鹅卵石"样内皮细胞特征;内皮细胞标志物Ⅷ因子表达阳性率达100%。结论本研究采用的方法简便易行,不需要胶原酶及内皮细胞生长补充物,更为经济适用,适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。

钙敏感受体在动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞中的表达

目的探讨钙敏感受体在动脉粥样硬化大鼠胸主动脉血管内皮细胞中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法 Wistar大鼠144只,随机分为对照组和动脉粥样硬化组,每组72只。动脉粥样硬化早期模型复制首先每千克体重注射维生素D360万单位,然后喂养高脂饲料6周。自动生化仪检测血清甘油三酯、总胆固醇;光镜观察胸主动脉形态学变化;TUNEL染色观察胸主动脉内皮细胞凋亡情况;采用RT-PCR和免疫印迹法分别检测胸主动脉血管内皮细胞中钙敏感受体、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,动脉粥样硬化组细胞凋亡指数以及钙敏感受体、Bax和Caspase-3的表达升高,Bcl-2的表达降低;光镜下可见胸主动脉部分内皮脱落,表面不光滑,中膜平滑肌细胞数目明显增多,排列紊乱。结论钙敏感受体可能参与了主动脉血管内皮细胞的凋亡,进而启动动脉粥样硬化的形成。

不同强度恒磁场对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响

目的:观察不同强度恒磁场对大鼠主动脉内皮细胞增殖的影响。方法:将体外培养3代的大鼠主动脉内皮细胞分为对照组及不同强度(0.5,1.0,5.0,10.0,100.0,500.0Gs)磁场组。磁场作用时间为48h,用四唑盐比色法测定细胞增殖。结果:与对照组相比,0.5,1.0,5.0Gs磁场组细胞增殖显著高于对照组(分别为0.301±0.023,0.308±0.042,0.294±0.025和0.230±0.026;t=11.20,8.65,7.92;P<0.05);10.0Gs磁场组细胞增殖与对照组相比无明显差异(0.228±0.034和0.230±0.026;t=0.26;P>0.05);100.0Gs和500.0Gs磁场组细胞增殖显著低于对照组(分别为0.173±0.022,0.166±0.015和0.230±0.026;t=9.17,11.68;P<0.05)。结论:0.5～5.0Gs的恒磁场可以促进大鼠主动脉内皮细胞的增殖,而100.0Gs以上恒磁场可抑制内皮细胞增殖。

单壁纳米碳管对大鼠主动脉内皮细胞损伤作用的研究

为了探索单壁纳米碳管(SWCNT)能否引起血管内皮细胞损伤及其可能的损伤机制,将大鼠主动脉血管内皮细胞暴露于不同浓度的SWCNT水溶液中(0.8、1.6、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200μg·mL-1)中染毒,染毒不同时间后测定细胞存活率、细胞内LDH和GSH含量并进行综合分析.结果表明,随着SWCNT染毒浓度和染毒时间的上升,大鼠主动脉血管内皮细胞存活率逐渐下降,死亡率逐渐上升;细胞内LDH在SWCNT染毒浓度为0￣100μg·mL-1范围内其释放随染毒剂量的增加而逐渐上升,在200μg·mL-1剂量组,其释放有所减弱;而细胞内GSH在SWCNT染毒浓度为0￣200μg·mL-1范围内其含量随染毒剂量的增加而逐渐下降.以上结果说明,SWCNT可致血管内皮细胞损伤,其机制可能为氧化损伤途径.

大鼠肺动脉内皮细胞的简易培养鉴定

目的：探索一种简单的方法培养大鼠肺动脉内皮细胞（ＲＰＡＥＣｓ）。方法：分离大鼠肺动脉，将其切成小块，使其内皮面贴于培养瓶，用含有２０％新生牛血清、肝素９０μｇ／ｍｌ、Ｌ－谷氨酰胺４ｍｍｏｌ／Ｌ、青霉素１００ｕ／ｍｌ和链霉素１００ｕｇ／ｍｌ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基培养。结果：培养２４ｈ后ＲＰＡＥＣｓ从动脉块游出，７２ｈ后将动脉块移去，ＲＰＡＥＣｓ于６～１０ｄ融合成单层细胞。这些细胞具有规律的鹅卵石样形成及Ⅷ因子相关抗原阳性。结论：本方法成功地培养出大鼠肺动脉内皮细胞并通过鉴定。

中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI-1表达影响

目的 :探讨中药芪丹通脉片对动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞及PAI 1的影响 .方法 :将 72只SD雄性大鼠随机分为 6个实验组 ,其中一组为阴性对照组 ,给以普通饮食 ,一组为模型组 ,给予维生素D3,高脂和高胆固醇饮食 ,其余 4组在给予高脂、高胆固醇饮食建立动脉粥样硬化大鼠模型同时给予芪丹通脉片低剂量组 [0 .36g/ (kg·d) ]、中剂量组 [1 .0 8g/ (kg·d) ]、高剂量组 [3.2 4g/ (kg·d) ]、阳性对照新伐他丁组 [4mg/ (kg·d) ](n =1 2 ) .1 6wk后电镜观察大鼠主动脉内皮细胞损伤情况 ,并通过逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)检测PAI 1表达 .结果 :模型组内皮细胞损伤最严重、PAI 1表达明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ;给予芪丹通脉片大鼠内皮细胞损伤减轻、PAI 1表达显著降低 ,中药高剂量组结果接近辛伐他丁组 .结论 :动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞损伤严重 ,其PAI 1表达增强 ,使用芪丹通脉片可明显改善内皮损伤程度 ,同时降低PAI 1表达 ,且其低、中、高浓度组PAI 1表达依次减少 (P <0 .0 5 ) .

野百合碱所致肺动脉高压大鼠模型中碱性成纤维细胞生长因子、内皮素-1及其受体的表达和外源性NO的作用

目的 :探讨野百合碱 (MCT)肺动脉高压模型大鼠肺组织中碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、内皮素 - 1(ET - 1)和内皮素A受体 (ETAR)的表达 ,并观察吸入外源性NO的作用。方法 :通过腹腔注射MCT建立肺动脉高压大鼠模型 ;使用NO吸入装置给予大鼠外源性NO ;采用免疫组织化学方法定量检测不同组间肺组织中bFGF、ET - 1及ETA 受体的表达。结果 :模型组肺动脉压、右心室肥厚程度、bFGF、ET - 1及ETA 受体的表达明显高于对照组 ,外源性NO吸入能明显减低肺动脉压、右室肥厚程度、bFGF、ET - 1及ETA 受体的表达。结论 :bFGF、ET -1及ETA 受体可能参与了MCT所致肺动脉高压的发生发展 ,外源性NO吸入可能通过ET - 1及ETA 受体途径阻止或逆转肺动脉高压的发展 ,但如何通过bFGF起作用还有待探讨。

内皮祖细胞移植修复大鼠颈总动脉内皮损伤

【目的】探讨内皮祖细胞修复动脉内皮损伤的作用。【方法】建立大鼠颈总动脉内皮损伤模型,16只大鼠随机等分为内皮祖细胞移植组和对照组。体外诱导大鼠外周血单个核细胞为内皮祖细胞。在动脉损伤后,将5-溴脱氧尿苷标记的内皮祖细胞注入损伤动脉段,14d后取损伤动脉段和对侧正常动脉段。采用病理学方法、免疫组织化学和图像分析技术评价内皮祖细胞的修复效果。【结果】内皮祖细胞移植组的损伤动脉段5-溴脱氧尿苷免疫组化为阳性。内皮祖细胞移植组损伤动脉段的新生内膜厚度较对照组明显减轻(43.5±5.5)μmvs(90.7±12.7)μm,P<0.05;内皮祖细胞移植组的再内皮化程度明显高于对照组77.8%±0.1%vs52.2%±0.1%,P<0.05。【结论】内皮祖细胞具有修复动脉内皮细胞损伤的作用,内皮祖细胞可作为心血管疾病细胞移植疗法的种子细胞。

通塞脉片对大鼠实验性动脉粥样硬化模型血管内皮细胞的影响

目的:研究通塞脉片(当归、党参、黄芪、石斛、川芎、金银花、牛漆、甘草)(TSM)对大鼠实验性动脉粥样硬化内皮细胞的影响。方法:50只♂性wistar大鼠,随机分为空白组、模型组、辛伐他汀组、TSM高剂量和低剂量组,除空白对照组给以普通饲料喂养外,其他组均饲以高脂饲料及维生素D3,建立食饵性动脉粥样硬化模型。12周后检测外周血循环内皮细胞(CEC)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、电镜观察动脉血管形态。结果:模型组大鼠CEC明显增加,AngⅡ含量显著升高,TSM能够减少CEC,降低AngⅡ含量。透射电镜观察模型组大鼠主动脉内皮严重受损;TSM组大鼠主动脉内皮细胞扁平形态基本完整,内弹性膜平整厚度均匀,损伤明显减轻。结论:TSM通过减少CEC数量、降低AngⅡ水平,达到保护大鼠实验性动脉粥样硬化模型内皮细胞的作用。

大鼠主动脉内皮细胞原代培养的研究

目的建立简单有效且重复性高的大鼠主动脉血管内皮细胞体外原代培养技术。方法取大鼠主动脉,将主动脉内膜暴露于外,采用不同浓度的Ⅰ型胶原酶以及不同消化时间对组织块进行预消化,然后将大鼠主动脉切成小块按内膜朝下贴在鼠尾胶原包被的培养瓶上进行培养。结果2.0g·L-1型胶原酶消化1h的组织块细胞迁出速度且组织迁出率明显提高(P<0.05),组织贴壁后24h即可见内皮细胞从组织块周围游离出来,呈短梭形或类三角形,d4～5即可进行传代培养,传代后d3～4即可融合成单层,呈典型“铺路石”状排列,经免疫组化S-P法鉴定有第Ⅷ因子相关抗原存在,进一步确认其为内皮细胞。结论经2.0g·L-1Ⅰ型胶原酶消化1h的组织块,组织块迁出率及内皮细胞迁出速度明显提高,从而大大缩短原代培养的时间。

三种分离大鼠主动脉内皮细胞方法的比较研究

血管内皮细胞由于具有多种生物学功能而成为体外研究血管病理生理的良好载体。虽然人脐静脉内皮细胞易于获得和培养，已被广泛用于血管内皮的研究，但其来源于静脉，对于很多发生在动脉的疾病，如动脉粥样硬化等的研究并不可行，所以分离和培养动脉内皮细胞非常重要。

大鼠颈动脉球囊损伤后管壁血管内皮生长因子和血管内皮细胞黏附分子1表达及雷公藤多甙的干预

目的:观察不同剂量雷公藤多甙对颈动脉球囊损伤后大鼠血管内皮生长因子、血管内皮细胞黏附分子1的影响,探讨雷公藤多甙在再狭窄防治方面的作用。方法:实验于2006-01/05在上海复旦大学医学院动物实验中心及上海瑞金医院烧伤研究所完成。①实验材料:SPF级SD雄性大鼠32只;雷公藤多甙(复旦复华药业)。②实验分组:随机分为正常对照组、模型组、雷公藤多甙小剂量组、大剂量组各8只。③实验干预:采用右颈动脉内膜剥脱法制备大鼠颈动脉狭窄模型。模型组术后予蒸馏水3mL/(kg·d)灌胃,雷公藤多甙小剂量和大剂量组分别给予雷公藤多甙30,60mg/(kg·d)灌胃。④实验评估:于术后2周麻醉后处死各实验组动物,取材,采用免疫组织化学方法检测大鼠颈总动脉血管内皮生长因子和血管内皮细胞黏附分子1含量。结果:32只大鼠全部进入结果分析。①正常大鼠颈动脉血管壁少量表达血管内皮生长因子,球囊损伤后表达量增加,雷公藤多甙大、小剂量组血管内皮生长因子表达的趋势与模型组基本相同,但表达量较模型组明显增加,雷公藤多甙小剂量组与模型组比较,P<0.05;大剂量组与模型组相比,P<0.01。②正常大鼠颈动脉管壁少量表达血管内皮细胞黏附分子1。球囊损伤后,模型组管壁血管内皮细胞黏附分子1表达增加;雷公藤多甙小剂量组和大剂量组管壁血管内皮细胞黏附分子1表达的趋势与模型组基本相同,但数量明显下降,雷公藤多甙小剂量组与模型组比较,P<0.05,大剂量组与模型组比较P<0.01。结论:雷公藤多甙能有效促进内皮细胞生成,减少内皮细胞间的黏附,对大鼠血管球囊损伤后的狭窄有一定的防治作用。

黄芪甲苷对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体损伤的保护作用

目的:研究黄芪甲苷对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体损伤的保护作用。方法:采用两肾一夹制备肾血管性高血压大鼠,术后2周将大鼠随机分为手术组和黄芪甲苷治疗组[5.0 mg/(kg·d)],以假手术组为正常对照,治疗2周后,观察大鼠胸主动脉内皮细胞线粒体超微结构的变化,应用免疫组化染色法观察大鼠胸主动脉内皮细胞锰超氧化物歧化酶(SOD2)的表达。结果:术后2周大鼠收缩压明显高于正常对照大鼠。手术组大鼠胸主动脉内皮细胞线粒体内嵴断裂、消失,基质电子密度降低,肿胀、空泡化明显;黄芪甲苷治疗后大鼠胸主动脉内皮细胞线粒体损伤程度明显减轻。手术组大鼠胸主动脉内皮细胞SOD2表达水平较正常对照大鼠明显降低,黄芪甲苷治疗后恢复至正常大鼠水平。结论:黄芪甲苷对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体的损伤有保护作用,上调主动脉内皮细胞SOD2表达是其可能途径之一。

内皮祖细胞移植对动脉粥样硬化模型大鼠脑缺血再灌注后学习记忆能力与脑顶叶皮质的影响

目的探讨内皮祖细胞(EPCs)移植对动脉粥样硬化(AS)模型大鼠脑缺血再灌注损伤(IRI)后学习记忆能力与脑顶叶皮质结构的影响。方法高脂膳食饲养建立30只动脉粥样硬化大鼠模型,随机分为AS组,IRI组和EPCs移植组。采集骨髓分离EPCs并体外扩增培养,检测其表面标记物的表达;第7天采用线栓法制作局灶性IRI模型,建模成功后1d EPCs移植组经尾静脉移植EPCs,IRI组与AS组给予等量体积的磷酸盐缓冲液。移植后7d检测各组大鼠的行为能力、脑组织血管内皮生长因子(VEGF)含量及其mRNA表达与其结构的病理改变。结果培养24h后见细胞贴壁生长逐渐变为梭形;第3天细胞明显增殖集落形成;第5天细胞集落逐渐增大呈现克隆样生长;第7天细胞汇合达80%;第10～14天细胞基本铺满瓶底呈铺路石样密集排列。荧光显微镜下,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。与IRI组相比,EPCs移植后大鼠的学习记忆能力较IRI组明显改善,VEGF含量及其mRNA表达显著下降(P<0.05)。光镜下,EPCs移植组大鼠脑缺血侧顶叶皮质Caspase-3和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性神经元均较IRI组明显下降(P<0.05)。结论 EPCs移植能改善AS模型大鼠脑IRI后的学习记忆能力、减轻脑组织的病理损害,这些变化提示EPCs促进了神经的修复。

简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

目的:探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法:将鼠主动脉内膜翻向外,结扎两端,置于50mL培养瓶中培养、传代,Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果:培养6～8d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长;12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面,约80%的细胞汇合成单层;传代细胞生长旺盛;细胞汇合后呈现典型的"鹅卵石"样内皮细胞特征,内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性;未见杂细胞。结论:此方法无损伤、不需要酶消化,能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞,适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。

内皮素对大鼠肺动脉平滑肌细胞膜钾通道的影响

目的 观察内皮素 (ET 1)对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)膜电压门控钾通道 (KV)的作用。方法 用全细胞膜片钳记录方法研究ET 1对膜电位 (Em)、膜电容 (Cm)、电压门控钾电流 (IKV)的影响。结果 ET 1可引起PASMCs去极化 ,并抑制IKV,抑制IKV 时间明显早于其对Em 变化的影响 ,ET 1对IKV 的影响呈可逆性和浓度依赖性 ,在有钙的环境中 ,ET 1对IKV 峰电流的抑制率明显高于无钙时。结论 ET 1可浓度依赖性的抑制IKV ,使常氧大鼠PASMCs去极化 ,且ET 1对IKV 的抑制作用早于对Em 的影响 ,这些作用不完全依赖于钙的参与 ,但钙可加强ET 1对IKV 的抑制作用。

一种大鼠主动脉内皮细胞分离培养的改良方法

目的探索一套原代培养大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)简单实用的方法体系。方法 SD大鼠两只,无菌环境下分离胸腹主动脉,清除脂肪、结缔组织。显微剪剪开主动脉,内膜面向下贴附于少量Ⅰ型胶原酶上消化60min。离心收集内皮细胞置于1%明胶包被的六孔板,加入20%胎牛血清的M199中培养。3～4天后换液更换内皮细胞培养基(ECM)培养。当细胞长满约90%底面积时,玻璃探针机械剔除成纤维样细胞后传代。倒置显微镜和抗Ⅷ因子抗体对细胞分别做形态学和免疫细胞化学鉴定。结果原代培养3～4天时,少量细胞开始贴壁并分裂生长。更换ECM后细胞增殖迅速,培养8～10天时可见细胞长满90%左右的底面积,呈典型的"铺路石"或"鹅卵石"征。免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的内皮细胞中有特定Ⅷ因子表达。原代周期8～10天,传代周期3～4天,经纯化传代后纯度接近100%。传至第6代仍未见细胞分裂增殖活性下降。结论本实验体系培养RAEC简单有效,重复性良好。获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握。