丹参通络解毒汤含药血清调控MALAT1对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞的保护作用及机制研究

目的研究丹参通络解毒汤含药血清调控转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)的保护作用及机制。方法体外培养大鼠CMECs,构建缺氧/复氧损伤细胞模型,转染过表达/沉默空白MALAT1慢病毒,将细胞分为过表达空白+中药组、过表达MALAT1+中药组、过表达MALAT1组、沉默空白+中药组、沉默MALAT1组、沉默MALAT1+中药组,分别予相应血清培养,免疫荧光染色检测Beclin-1蛋白表达,Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(SRPK1)、丝氨酸丰富剪接因子1(SRSF1)、血管内皮生长因子(VEGF)及Bax蛋白表达,RT-PCR检测MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达。结果与过表达空白+中药组比较,过表达MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达升高,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01),VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与过表达MALAT1组比较,过表达MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.05);与沉默空白+中药组比较,沉默MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.01);与沉默MALAT1组比较,沉默MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),VEGF表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论上调MALAT1表达可促进缺氧/复氧损伤模型CMECs自噬,丹参通络解毒汤含药血清能通过抑制MALAT1表达抑制自噬、促进血管新生,其机制可能与下调SRPK1、SRSF1表达有关。

舒洛地特激活AMPK/SIRT1通路减轻高糖诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤

目的:探讨舒洛地特(SDX)减轻高糖(HG)诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)氧化应激和凋亡的作用及其机制。方法:分离培养大鼠CMEC,随机分为对照组、HG组、HG+SDX组。CCK-8法检测细胞存活率。利用DCFH-DA作为荧光探针,测定各组DCF荧光强度以判定细胞内活性氧(ROS)水平。比较各组细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。采用流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡率,western blotting法检测AMPK、磷酸化(p-)AMPK、SIRT1蛋白表达。结果:与对照组相比,HG组CMEC细胞存活率降低,细胞上清液中MDA含量增高,SOD活性降低,ROS水平和细胞凋亡率升高,p-AMPK、SIRT1蛋白表达水平下降(均P<0.05)。与HG组比较,HG+SDX组CMEC的细胞存活率显著提升,MDA、ROS生成减少,SOD活性升高,CMEC凋亡率下降,p-AMPK、SIRT1蛋白表达水平升高(均P<0.05)。结论:SDX可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路,减轻HG诱导的CMEC的氧化应激及细胞凋亡,从而发挥心血管保护作用。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

沉默YTH结构域家族蛋白2改善血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡

目的探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组。为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2组[转染YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型组(siRNA+AngⅡ)和实验组(siYTHDF2+AngⅡ)。用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系。结果AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P<0.05)。与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平。

松弛素抑制氧化应激反应保护小鼠心肌微血管内皮细胞的缺氧/复氧损伤

背景:松弛素是人松弛素2的重组形式,作为机体内源性抗纤维化活性物质,松弛素治疗可能会缓解急性心力衰竭患者的症状并改善其预后,但尚未有研究松弛素在氧化应激方面对缺氧/复氧损伤小鼠心肌微血管内皮细胞(H5V)的作用。目的:探讨松弛素在小鼠H5V细胞缺氧/复氧损伤模型中的作用。方法:建立小鼠H5V细胞缺氧/复氧损伤模型,分别为缺氧3,6,12 h,复氧3 h,通过检测细胞活力和乳酸脱氢酶活性确定细胞缺氧/复氧的最佳时间。选用不同质量浓度的松弛素(0,60,100,140,180 ng/mL)作用于H5V细胞缺氧/复氧损伤模型,通过检测细胞活力和乳酸脱氢酶活性确定松弛素干预的最佳质量浓度。在此基础上,将H5V细胞分为3组:对照组、缺氧/复氧模型组、缺氧/复氧+180 ng/mL松弛素组,检测丙二醛、超氧化物歧化酶和活性氧水平。结果与结论:(1)与对照组比较,缺氧6 h/复氧3 h、缺氧12 h/复氧3 h的细胞活力均显著降低(P<0.05),细胞上清中乳酸脱氢酶活性均显著增加(P<0.05),选取缺氧6 h/复氧3 h进行后续实验;(2)与缺氧/复氧模型组比较,缺氧/复氧+松弛素180 ng/mL组细胞活力显著增加(P<0.05),细胞上清中乳酸脱氢酶活性显著降低(P<0.05),选取松弛素180 ng/mL进行后续干预实验;(3)与缺氧/复氧模型组比较,缺氧/复氧+180 ng/mL松弛素组活性氧、丙二醛水平显著降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平显著增加(P<0.05);(4)结果表明,H5V细胞经缺氧6 h/复氧3 h可建立H5V细胞损伤模型,经180 ng/mL松弛素干预后提高了细胞活性和细胞抗氧化应激能力。

差异过筛法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的:采用差异过筛法培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)。方法:取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、细胞筛网过滤、收集网下滤过物、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO_(2)培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、血管性血友病因子(vWF)免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果:培养24 h后血管段周围爬出短梭形的细胞;48 h后岛屿状的细胞集落形成;72 h后细胞铺满瓶底,呈典型的单层、铺路石样、镶嵌式贴壁生长;免疫细胞化学染色显示,所培养细胞的细胞质呈现棕红色,vWF表达为阳性。结论:差异过筛法能够成功分离培养出原代大鼠BMECs。

丹参通络解毒汤对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞自噬的影响

目的 观察丹参通络解毒汤对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)自噬的影响,探讨其保护CMECs的机制。方法 体外培养CMECs,复制缺氧/复氧损伤细胞模型,通过慢病毒转染沉默MALAT1,将细胞分为过表达SRPK1组、过表达SRPK1联合含药血清组、空载组、空载联合含药血清组,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3B及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达,RT-PCR检测LC3B mRNA表达,免疫荧光染色检测LC3B表达。结果 与过表达SRPK1组比较,过表达SRPK1联合含药血清组和空载组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高,Bax和Beclin1蛋白表达、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及LC3B mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与过表达SRPK1联合含药血清组比较,空载联合含药血清组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高,Bax和Beclin1蛋白表达、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及LC3B mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01);与空载组比较,空载联合含药血清组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高,Bax和Beclin1蛋白表达、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及LC3B mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论 丹参通络解毒汤能抑制缺氧/复氧损伤引起的CMECs自噬,进而保护CMECs,其机制可能与下调MALAT1表达,抑制SRPK1表达有关。

大鼠原代脊髓微血管内皮细胞的体外分离培养及鉴定

目的:建立一种简单高效的大鼠原代脊髓微血管内皮细胞培养方法。方法:分离大鼠脊髓组织,经剪碎、细胞筛网过滤、Ⅱ型胶原酶消化后接种培养。通过细胞形态学观察、FⅧRag免疫细胞化学染色鉴定所培养的目的细胞。结果:接种的脊髓微血管段呈“短棍样”,培养24 h后有少量短梭形细胞从血管段周围迁移爬出,48 h后逐渐形成“岛屿状”的细胞集落,72 h后细胞铺满皿底,呈典型的单层、“鹅卵石样”、镶嵌式排列生长;细胞FⅧRag免疫细胞化学染色显示细胞质呈棕红色,表达为阳性。结论:该方法可成功分离培养出活性好、纯度高的大鼠原代脊髓微血管内皮细胞。

丹参通络解毒汤联合METTL3对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生的影响

目的探讨丹参通络解毒汤联合甲基转移酶样3(METTL3)对缺氧/复氧(H/R)大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的影响及可能作用机制。方法建立H/R损伤CMECs模型,将细胞分为空白组、模型组、沉默组、过表达组、中药+沉默组、中药+过表达组,细胞划痕实验观察CMECs迁移情况,CCK-8法检测CMECs增殖能力,RT-PCR检测CMECs血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达,Western blot检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组CMECs迁移率、细胞活力明显降低,VEGF mRNA和eNOS蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,沉默组CMECs迁移率、细胞活力明显降低,VEGF mRNA表达明显降低(P<0.05),过表达组、中药+沉默组、中药+过表达组CMECs迁移率、细胞活力明显增加,VEGF mRNA和eNOS蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与沉默组比较,中药+沉默组CMECs迁移率、细胞活力明显增加,VEGF mRNA和eNOS蛋白表达明显升高(P<0.01);与过表达组比较,中药+过表达组CMECs迁移率、细胞活力明显增加,VEGF mRNA和eNOS蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论丹参通络解毒汤联合METTL3可促进H/R损伤CMECs增殖,提高CMECs迁移率,促进血管新生,保护受损CMECs,其机制可能与上调VEGF、eNOS有关。

单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的 采用单筛过滤法获取脑微血管以培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞。方法 取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、单层细胞筛网过滤、收集网上截留组织、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO_(2)培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养24 h后,短梭形细胞从脑微血管段周围爬出;48 h后“岛屿状”的细胞团簇形成;96 h后细胞融合,呈典型的单层、“铺路石样”、镶嵌式贴壁生长。第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测显示细胞胞质呈现棕红色,表达为阳性。结论 单筛过滤法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。

薄层液面培养法提取大鼠原代脑微血管内皮细胞及对其的鉴定

目的:采用薄层液面培养法提取大鼠原代脑微血管内皮细胞(BMECs)。方法:取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、过筛、Ⅱ型胶原酶消化后获得脑微血管段,并严格精准控制培养液的用量,将其接种于培养皿中进行原代培养。通过倒置相差显微镜对目的细胞的形态学观察、免疫细胞化学染色法对细胞第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRag)的检测进行鉴定。结果:镜下观察到所培养的目的细胞呈典型的单层、铺路石样、镶嵌式排列生长;FⅧRag阳性细胞率达99%以上。结论:薄层液面培养法能够成功分离培养出活性强、纯度高的大鼠原代BMECs。

小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及生物学特性

目的:探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞的生物学特性。方法:以多聚赖氨酸对培养皿作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法,结合内皮细胞专用培养基,分离培养微血管内皮细胞并进行扩增。利用倒置显微镜观察细胞生长情况;台盼蓝法、绘制生长曲线和MTT法分别测定心肌微血管内皮细胞传代成活率、不同代生长及增殖特征;以DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标,结合CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定细胞表面特异性抗原;体外血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功能。结果:酶消化、差速贴壁法分离培养2 d后,细胞呈散在的、小簇状聚集性生长,4～5 d迅速生长呈单层排列,细胞为梭形、三角形或多角形,7～8 d后呈铺路石样即可传代;传代细胞经台盼蓝法检测成活率均为95%以上;第1、3代细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示第1、3代细胞在第2～4 d吸光度变化较明显(P<0.05);随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,吸光度无明显变化,细胞逐渐衰老;DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标阳性率为(89.2±3.5)%,相关特异性抗原CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定阳性率为(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%;体外血管形成实验显示,6～12 h后出现明显的管腔结构。结论:以多聚赖氨酸作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁法并结合内皮细胞专用培养基,可获得纯度较高的小鼠心肌微血管内皮细胞,为心脏疾病的研究提供种子细胞。

脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨低氧微环境诱导下脂肪间充质干细胞(ADSCs)外囊泡(Evs)通过增加微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达对人微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:分离大鼠ADSCs,并通过成骨、成脂分化和细胞表面标志物的表达进行鉴定。利用常氧(21%O2)和低氧(1%O2)条件分别获得常氧Evs和低氧Evs,通过形态和表面标志物的表达进行鉴定。构建心肌微血管内皮细胞(CMECs)细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,并将CMECs分为对照组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R组)、常氧Evs组(N-Evs组,给予常氧Evs培养24 h)、低氧Evs组(H-Evs组,给予低氧Evs培养24 h)、低氧Evs+自噬抑制剂组(H-Evs+3-MA组,给予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培养24 h)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验和透射电镜分别检测CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力;采用酶联免疫吸附法(Western Blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、基质金属蛋白酶(MMP)-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、LC3B、重组人自噬效应蛋白1(Beclin1)蛋白表达。结果:与Control组比较,OGD/R组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。与OGD/R组比较,N-Evs组和H-Evs组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力增强(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加(P<0.05),且H-Evs组优于N-Evs组(P<0.05)。与H-Evs组比较,H-Evs+3-MA组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。结论:低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达可促进OGD/R损伤CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的探讨大鼠心肌微血管内皮细胞(RMMEC's)体外培养方法的改良。方法采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论本方法可获得纯度高、结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。

天麻素抑制Keap1/Nrf2-泛素-蛋白酶体信号对高糖诱导原代大鼠心肌细胞损伤的作用及机制

目的探讨天麻素(GAS)抑制Keap1/Nrf2-泛素-蛋白酶体信号对高糖诱导原代大鼠心肌细胞损伤的作用及其机制。方法利用40 mmol/L高糖制作原代大鼠心肌细胞尿病心肌细胞损伤模型,将细胞分为正常对照组(25 mmol/L葡萄糖)、模型组、GAS低剂量(0.75μmol/L)治疗组、GAS高剂量(1.5μmol/L)治疗组及阳性药(二甲双胍,0.2 mmol/L)治疗组;48 h后取出细胞;利用吉姆萨染色法观察细胞形态变化,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH外漏率,蛋白免疫印迹法检测血心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、Keap1及血红素氧合酶1(HO-1)的表达,免疫荧光法检测Nrf2;为进一步研究GAS对蛋白酶体的作用,引入蛋白酶体抑制剂MG132,并将细胞分为正常对照组、模型组、MG132治疗组(1.0μmol/L)、GAS治疗组(1.5μmol/L)及MG132与GAS联合治疗组(1.0μmol/L MG132+1.5μmol/L GAS),利用蛋白免疫印迹法检测细胞中Nrf2,Keap1及泛素-蛋白酶体相关蛋白泛素激活酶(UBE1)、人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)、人蛋白酶体亚基α7(PSMA7)的表达,免疫荧光法检测Nrf2,免疫沉淀法检测泛素化Nrf2的表达。结果GAS可改善高糖诱导原代大鼠心肌细胞形态损伤、降低LDH外漏率(P<0.05);模型组细胞中ANP,BNP,Keap1,UBE1、PSMD11,PSMA7与泛素化的Nrf2的表达增加(P<0.05),Nrf2与HO-1的表达降低(P<0.05);给予不同浓度的GAS与阳性药二甲双胍后、可部分逆转上述蛋白的表达(P<0.05);GAS还可在一定程度上改善Nrf2的入核情况,同时GAS与MG132均有效下调模型组细胞中UBE1、PSMD11、PSMA7、Keap1与泛素化的Nrf2的表达(P<0.05),并增加Nrf2的表达(P<0.05),但GAS与MG132联用与单独使用GAS相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论GAS可以改善高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤,其机制可能是通过抑制Keap1介导Nrf2的泛素化、同时减少Nrf2的降解而抑制蛋白酶体活性。

CCL2促进大鼠原代心肌微血管内皮细胞血管形成

本文旨在探讨趋化因子CCL2在成年大鼠原代心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cell, CMEC)血管形成中的作用。分离原代大鼠CMEC,用CD31和VIII因子免疫染色鉴定,观察不同时间点基质胶(Matrigel)上CMEC血管形成情况,用real-time RT-PCR和ELISA分别检测在血管形成过程中CCL2的表达和分泌情况。结果显示:(1)大鼠原代CMEC分离成功,该细胞具有形成血管能力,成网数和节点数在Matrigel处理后4 h显著增加;(2) CMEC血管形成过程中CCL2和CCR2的表达量显著上调,并且CCL2的分泌量明显增加;(3) CCL2阻断抗体和CCR2拮抗剂均可显著降低CMEC血管形成能力。上述结果提示,大鼠原代CMEC在血管形成过程中可分泌CCL2,并且CCL2-CCR2信号通路促进了CMEC血管形成。

大鼠心肌微血管内皮细胞的体外原代培养

目的体外原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs),并观察其生长特性。方法采用酶蛋白消化法培养大鼠MMVECs,用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化细胞,用第Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原鉴定细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。结果成功培养出纯度很高的MMVECs,可用于MMVECs相关实验研究。结论此原代培养MMVECs的方案具有较好的可操作性和可重复性。

免疫磁珠法分离培养小鼠原代骨骼肌微血管内皮细胞及鉴定

目的旨在建立一种有效分离、培养、扩增小鼠原代骨骼肌微血管内皮细胞(MMECs)的方法。方法采用胶原酶消化法、差速贴壁法以及免疫磁珠法分离纯化骨骼肌微血管内皮细胞,贴壁培养进行体外扩增。利用相差显微镜观察培养细胞的形态、MTT法测定细胞的生长情况、CD31免疫荧光染色对其表型进行鉴定、流式细胞术鉴定细胞纯度。结果实验成功获取小鼠骨骼肌微血管内皮细胞,小鼠原代骨骼肌微血管内皮细胞在培养24 h后迅速贴壁,(3~6)d内迅速生长,呈梭形,单层排列,培养(6~8)d可长满培养皿底,呈铺路石样排布。MTT法测得培养第2代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。流式细胞术检测经差速贴壁联合磁珠纯化的CD31+的MMECs细胞可达97%以上。结论成功建立了一种简单、高效的分离小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的方法,为开展与骨骼肌微血管内皮细胞相关研究提供了良好的实验方法和技术手段。

乳鼠心肌微血管内皮细胞体外原代培养与鉴定的实验研究

目的探讨体外原代培养与鉴定纯度、成活率均较高的乳鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)的方法。方法双酶消化法分离原代SD乳鼠CMECs并以差速贴壁法进行纯化,倒置显微镜观察细胞生长状态。Ⅷ因子及CD31抗体免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。台盼蓝染色测定细胞存活率,并以AnnexinⅤ&PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率。结果倒置相差显微镜观察细胞呈管腔样、铺路石样生长,Ⅷ因子及CD31抗体免疫细胞化学染色双阳性细胞>95%,台盼蓝染色及AnnexinⅤ&PI双标记流式细胞术检测细胞存活率>95%。结论此方法成功培养与鉴定出纯度及存活度较高的CMECs。

黑斑侧褶蛙脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定

为了建立蛙脑微血管内皮细胞原代培养方法,实验以黑斑侧褶蛙脑组织为实验材料,在无菌条件下分离出大脑灰质,利用0.1%Ⅱ型胶原酶和胶原酶-分散酶进行消化,经过Percoll密度梯度离心后,将获取的脑微血管段接种于鼠尾胶包被的培养瓶中,于28℃、5%CO_(2)条件下原代培养蛙脑微血管内皮细胞,并通过细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫荧光对细胞进行鉴定,最后用四唑蓝比色法(MTT)测定细胞的生长状态。结果显示,微血管段在体外培养1 d后开始贴壁生长,并逐渐扩大成团簇状,培养至7 d时,细胞呈“铺石路样”镶嵌式排列,表现为区域性单层生长;Ⅷ因子免疫荧光检测发现胞质呈红色,表达为阳性,阳性细胞率达97%以上;MTT实验显示,细胞在第3~5天时生长速率最快。本研究首次建立了蛙脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定方法,为体外研究蛙类神经性疾病的发病机理奠定基础,也为相关药物的研发和筛选提供了细胞模型。