大鼠巨噬细胞感染弓形虫的基因表达谱分析

目的分析大鼠腹腔和肺泡巨噬细胞感染弓形虫RH株的基因表达谱差异。方法以弓形虫RH株速殖子感染SD大鼠腹腔和肺泡巨噬细胞0h、6h后提取细胞总RNA,采用NimbleGen 12x135K微阵列基因表达分析芯片检测差异表达基因,并对部分表达变化的基因进行Real time PCR验证。结果表达分析芯片涵盖大鼠26 419个基因,对差异表达基因(Fold Change≥4.0)进行聚类分析显示,经弓形虫RH株作用6h和0h的RNA表达谱相比,大鼠肺泡巨噬细胞上调的基因有49个(主要包括Zfp90,Map4k4,Mrpl42等),下调的基因有130个(主要包括Pitx1,Chpt1,Chd6等)。大鼠腹腔巨噬细胞上调的基因有136个(主要包括Map2k3,Il17b,Phka2等),下调的272个(主要包括Tlr2,Tgfb2,Wnt2等)。GO、Pathway分析差异表达的基因,大鼠腹腔巨噬细胞能够引发更多和弓形虫有关的信号通路变化,其肺泡巨噬细胞则不能引起这一效应。Real time PCR和基因芯片检测结果一致。结论大鼠腹腔和肺泡巨噬细胞感染弓形虫不同的表现型,可能和其基因表达差异引起的信号通路变化有关。

前列腺素E_2对大鼠巨噬细胞株NR8383合成血管内皮生长因子促进人脐静脉血管内皮细胞成管、迁移的影响

目的探究前列腺素E_2(PGE_2)对大鼠巨噬细胞株NR8383细胞合成血管内皮生长因子(VEGF)的调控作用以及对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)趋化成管的影响。方法分别采用0.1 nmol/L PGE_2、1 nmol/L PGE_2、1 nmol/L PGE_2+10 nmol/L EP2受体抑制剂AH6809+10 nmol/L EP4受体抑制剂AH23848处理的NR8383细胞作为各实验组,选择未经PGE2以及其特异性受体抑制剂处理的NR8383细胞作为对照组,采用Western blot和qPCR方法检测各组NR8383细胞内VEGF蛋白以及m RNA的表达水平;收集以上各处理组的细胞培养上清液分别刺激HUVECs,运用TRANSWELL小室、Matrigel胶细胞成管实验等实验方法,观察PGE_2调控巨噬细胞对HUVEC迁移效应和成管能力的影响。结果随着NR8383细胞培养液中加入PGE_2浓度增高,其VEGF蛋白表达和VEGF mRNA的表达水平显著升高(P<0.05);0.1 nmol/L、1 nmol/L PGE_2处理过的NR8383细胞培养上清液可以显著增加HUVEC细胞形成的小管面积,形成小管面积随着PGE_2处理浓度的增加而增加(P<0.05);HUVECs的迁移运动也随着PGE_2处理浓度的升高不同程度的增强,HUVECs趋化的数量显著升高(P<0.05);研究发现PGE_2特异性的EP2/EP4受体拮抗剂AH6809/AH23848,可以显著抑制PGE_2增强NR8383细胞内VEGF mRNAs表达的作用并且也显著抑制PGE2增强NR8383细胞促进HUVECs成管和趋化能力的效应(P<0.05)。结论 PGE2可以通过作用NR8383细胞表面对应的EP2/EP4受体调控VEGF的合成,促进HUVEC趋化和成管效应。

艾拉莫德对脂多糖激活大鼠肺泡巨噬细胞系TNFα产生及NF-κB活性的抑制作用

目的研究非甾体抗炎药艾拉莫德(T-614)对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肺泡巨噬细胞系(NR8383)前炎症反应因子TNFα基因表达、蛋白合成的影响及其对核因子κB(NF-κB)的作用。方法体外培养NR8383经T-614(13.4,26.7及53.4μmol.L-1)处理,LPS刺激后应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中TNFα的水平,半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TNFαmRNA水平,ELISA法检测NF-κB的活性。结果T-614对LPS诱导的NR8383细胞TNFαmRNA水平和蛋白水平的上调有显著抑制作用,对NF-κB的转录活性也有抑制作用。结论T-614可能通过抑制LPS诱导的NR8383的NF-κB活性而降低TNFα的产生。

氯胺酮对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

目的研究氯胺酮对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肺泡巨噬细胞氧化应激的影响。方法体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383经氯胺酮(10、100和1000μmol/L)预处理,LPS刺激24 h后,应用试剂盒检测细胞培养上清液中丙二醛(MDA)及超氧化物岐化酶(SOD)的水平。结果与PBS组比较,LPS组培养上清液中MDA水平均明显增加,而SOD水平显著下降,而氯胺酮预处理组(100和1000μmol/L)对此具有抑制作用。结论氯胺酮对LPS所致的NR8383细胞的氧化应激损伤具有一定的保护作用。

赤芍、白芍凉血作用比较研究(Ⅰ)-LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞的作用研究

目的观察赤芍、白芍各醇提物对脂多糖(LPS)致大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)不同时间段活性的影响,比较赤芍、白芍各醇提物的凉血作用的异同。方法采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测LPS(1μg/mL)对NR8383细胞不同时间点的抑制率及赤芍、白芍(10μg/mL)对LPS诱导NR8383活性的调节作用。结果 1μg/mLLPS刺激NR8383 6h之前抑制率为负值之后逐渐转为正值,即先诱导其过度激活后促进其凋亡;观察到川赤芍、赤芍、白芍给药组能够在3h时显著抑制NR8383的过度活化,与LPS对照组比较具有显著差异(P<0.05);24h时各药物组均能够显著抑制NR8383的异常凋亡,与LPS对照组比较具有显著差异(P<0.05);24h时川赤芍、赤芍组与白芍组之间有显著差异(P<0.05)。结论赤芍、白芍是在共同具有凉血功效的前提下有所偏重。

氯胺酮对脂多糖诱发的大鼠肺泡巨噬细胞一氧化氮及氧自由基生成的影响

目的:研究氯胺酮对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肺泡巨噬细胞一氧化氮(NO)、羟自由基(.OH)及超氧阴离子(O2.-)生成的影响。方法:体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383分为对照组(C组),LPS组(L组)及不同浓度氯胺酮预处理组(K1、K2和K3组)。检测细胞培养上清液中NO、.OH及O2.-水平。结果:L组NO、.OH及O2.-水平显著高于C组,K2和K3组的NO、.OH及O2.-水平显著低于L组,K2和K3组间无统计学差异。结论:氯胺酮对LPS所致的NR8383的NO、.OH及O2.-的升高有抑制作用。

慢病毒介导siRNA干扰MyD88表达对大鼠肺泡巨噬细胞功能的影响

目的采用RNA干扰技术，通过构建表达大鼠髓样分化因子88（MyD88）siRNA慢病毒干扰大鼠肺泡巨噬细胞MyD88g／表达，检测其对细胞功能的影响。方法针对MyD88基因，设计并构建3对siRNA表达质粒，分别与预先构建好表达MyD88N质粒共转染HEK-293T细胞，Westernblot检测MyD88的表达情况，筛选出其中1对干扰效率最高的siRNA，用Gateways方法构建慢病毒干扰载体包装成慢病毒，将慢病毒转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383胞并加入内毒素（LPS）诱导，未转染慢病毒的细胞作为空白对照组和LPS激活组：空白对照组加入与LPS等体积的PBS；LPS激活组加入LPS刺激。ELISA测定各组细胞因子（IL-18、IL-6）释放情况。结果成功筛选出了1对干扰效率最高的siRNA并包装成慢病毒，病毒滴度为2．0×10^6TU／ml。LPS诱导后，与对照组相比．感染慢病毒的NR8383细胞MyD88表达明显受到抑制，IL-1β、IL-6的释放均显著减少，差异有统计学意义。结论慢病毒介导RNA干扰能够有效抑制NR8383细胞MyD88基因的表达，显著减少胞因子的释放，为以抗原提呈细胞（APC）为靶向的体内实验治疗大鼠肺移植相关闭塞性细支气管炎（obliterative bronchitis，OB）的研究提供了手段。

香菇多糖对大鼠肺泡巨噬细胞活性的影响

本实验观察香菇多糖对大鼠肺泡巨噬细胞活性的影响。实验组每日按4mg/kg 剂量腹腔注射香菇多糖,连续给药1个月,对照组未作任何处理,用生理盐水分别灌洗两组大鼠的肺泡巨噬细胞,生化方法测定巨噬细胞内酸性磷酸酶、精氮酸酶及乳酸脱氢酶的活性,结果发现实验组巨噬细胞内三种酶的活性均高于对照组,且有显著性差异(P<0.05～0.001),提示香菇多糖对大鼠肺泡巨噬细胞有激活作用。

地塞米松对大鼠腹腔巨噬细胞抗弓形虫感染及细胞因子分泌的影响

为探讨地塞米松(DXM)对大鼠腹腔巨噬细胞抗刚地弓形虫(T.gondii)和细胞因子分泌的影响,将大鼠随机分为2组,即DXM注射组和空白对照组,连续注射6d,再抽取腹腔巨噬细胞后分为4组,即DXM组和DXM+T.gondii感染组;对照组和T.gondii感染组。通过瑞-吉染色观察T.gondii在巨噬细胞内的增殖;并用半定量RT-PCR检测DXM组和对照组的大鼠腹腔巨噬细胞IFN-γ、TNF-α和IL-2mRNA表达情况用ELISA检测4个试验组细胞培养上清液中3种细胞因子的含量。结果显示,在正常大鼠腹腔巨噬细胞内T.gondii不增殖反而减少,而在DXM注射大鼠后巨噬细胞内T.gondii大量增殖;同时与T.gondii感染免疫密切相关的这3种细胞因子mRNA及其蛋白的表达均被DXM明显抑制。试验表明,大鼠腹腔巨噬细胞对T.gondii具有明显的抗性;但DXM又可诱发腹腔巨噬细胞易感T.gondii,这一结果与细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2表达下调有关。

纳米氧化铈对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的增殖影响

目的：研究纳米氧化铈对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的毒性作用和对细胞的增殖影响;考察纳米氧化铈作用于细胞的生物效应是否存在剂量和粒径效应。方法：不同终浓度200、100、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/m L的20.8 nm Ce O2-NPs体外作用于96孔板中NR8383细胞24 h,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力;四种粒径20nm、50-100 nm、300-500 nm、1-5μm Ce O2分别以四种终浓度100、50、20、10μg/m L作用于NR8383细胞24 h,采用CCK-8试剂盒检测检测细胞活力。结果：不同浓度20.8 nm Ce O2-NPs作用于NR8383细胞,与对照组相比,除1.25、2.5、5μg/m L外,其他浓度下细胞存活率随浓度增大而升高,100、200μg/m L最明显;有剂量效应。四种粒径四种浓度的纳米氧化铈作用于NR8383细胞,50-100 nm的20μg/m L浓度和1-5μm的50、10μg/m L浓度Ce O2-NPs抑制细胞增殖,但不明显;其他各组均促进细胞增殖,其中20 nm的20μg/m L,50-100 nm的50μg/m L、100μg/m L最明显。剂量尺寸效应不明显。结论：小粒径纳米氧化铈对NR8383细胞增殖有促进作用,无明显毒性;微米级氧化铈有些浓度下细胞存活率降低,可能对细胞造成毒性。

二氧化硅粉尘对实验大鼠肺泡巨噬细胞的毒性效应

目的观察二氧化硅粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞(AMs)的毒性作用。方法测定不同二氧化硅(SiO2)粉尘浓度培养AMs24小时以及培养不同时间的AMs上清中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量,并记录不同浓度粉尘刺激AMs的死亡率。同时以二氧化钛粉尘为阴性对照。结果巨噬细胞死亡率随粉尘浓度的增加而增加,AMs上清中LDH及MDA含量与SiO2粉尘浓度呈良好的剂量-反应关系,且与其刺激时间呈良好的时间-效应关系。结论染SiO2粉尘的实验大鼠巨噬细胞呈现明显的毒性效应。

氯胺酮对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞抗氧化能力的影响

目的研究氯胺酮对脂多糖（LPS）刺激的大鼠肺泡巨噬细胞（AM）抗氧化能力的影响。方法体外培养大鼠肺泡AM株NR8383经氯胺酮（10、100、1000μmol/L）预处理,LPS刺激24h后,应用试剂盒检测细胞培养上清液中总抗氧化能力（T-AOC）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平。结果与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较,LPS组培养上清液中T-AOC和GSH-Px水平均明显下降。低浓度氯胺酮预处理组（10μmol/L）与LPS组比较,差异无统计学意义。而较高浓度氯胺酮预处理组（100、1000μmol/L）与LPS组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论一定浓度氯胺酮对LPS刺激的NR8383细胞T-AOC和GSH-Px水平降低具有明显改善作用。

不同剂量射线对大鼠肺泡巨噬细胞增殖能力的影响

目的:观察不同剂量射线对大鼠肺泡巨噬细胞增殖能力的影响,为放射性肺损伤细胞模型建立奠定前期基础。方法:使用高能直线加速器X射线以不同剂量射线(0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy)照射大鼠肺泡巨噬细胞,分别于照射后24 h、48 h、72 h后观察细胞镜下形态,并用MTT法检测细胞增殖能力。结果:在不同时间节点,一个视野内,照射组细胞数量均少于正常组(0 Gy组),从细胞形态来看,0 Gy组细胞表现为大鼠肺泡巨噬细胞呈串样生长的特点,而照射组细胞则呈单个分散样生长;经MTT法检测,照射后各时间节点测定OD值分别为:0 Gy组,0.139、0.165、0.205; 2 Gy组,0.112、0.127、0.151; 4 Gy组,0.109、0.121、0.138; 6 Gy组,0.088、0.094、0.099。其中不同剂量射线照射组与正常组相比,吸光度值均有差异,P=0.000 <0.05;不同时间点,24 h,48 h,72 h,各组吸光度之间均有差异,P=0.000 <0.05;不同剂量照射组之间两两相比,2 Gy组与4 Gy组差异不明显,P=0.052> 0.05,6 Gy组与其他两组之间差异显著。结论:射线会对大鼠肺泡巨噬细胞的生长特性和增殖能力产生影响,使其串样生长特性消失,其中6 Gy剂量射线对细胞所产生的影响最大。

羧胺三唑对脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞iNOS蛋白的表达和NF-κB活化的影响

目的：本课题组前期的研究结果显示，羧胺三唑（CAI）在多种急性、亚急性和慢性炎症模型中均具有良好的抗炎作用。本研究以正常大鼠的腹腔巨噬细胞为研究对象，探讨可能具有潜在抗炎作用的抗肿瘤药物CAI对与多种炎症相关因子的体外调节作用。方法：收集正常大鼠的腹腔巨噬细胞，待细胞贴壁后，将一系列浓度的CAI与上述细胞共同孵育48小时后，利用MTT法测定CAI对正常大鼠腹腔巨噬细胞活力的影响。分别将5μm、10gm、20gm和40μm的CAI加入已经贴壁的巨噬细胞中，共同培养24小时，同时加入浓度为10μg／mL的脂多糖（LPS）以诱导上述细胞的活化。培养基上清中NO的含量和TNF-α的水平分别用硝酸还原法和TNF—αELISA检测试剂盒进行测定，用Westernblot法测定iNOS蛋白的表达和NF—κB活化情况。

二氧化钛纳米颗粒对大鼠肺泡巨噬细胞凋亡的影响研究

目的探讨不同粒径的二氧化钛纳米颗粒(TiO2-NPs)对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383凋亡的影响。方法大鼠肺泡巨噬细胞NR8383暴露于粒径为10、30、50、100 nm二氧化钛纳米颗粒48 h后,采用CCK-8法检测NR8383的细胞活力,Hoechst33258染色观察凋亡的核形态,PI单染流式细胞术检测凋亡情况。结果不同浓度不同粒径TiO2-NPs作用48 h后,与正常对照细胞组相比,NR8383细胞活力和凋亡率在同一粒径下随浓度增加而增加,同一浓度下随粒径增加而降低。结论二氧化钛纳米颗粒对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383凋亡有一定的影响,这与TiO2-NPs的粒径和浓度有关。

S100A8对大鼠肺泡巨噬细胞炎性因子释放水平的影响

目的:探讨S100A8 siRNA对脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383炎症介质释放水平的影响。方法:构建S100A8 siRNA载体,利用脂质体Lipofectamine^(TM)2000转染NR8383细胞,荧光定量PCR检测S100A8基因的沉默效率。不同浓度(0.1~10μg/mL)的脂多糖刺激S100A8沉默组和阴性对照组细胞2 h,酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中白细胞介素-6(IL-6)、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。结果:S100A8 siRNA转染至NR8383细胞后,S100A8 mRNA的表达降低(P<0.05)。随着脂多糖刺激浓度增加,S100A8沉默组和阴性对照组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α浓度均逐渐增加,各浓度组与0μg/mL组比较,差异有统计学意义(P<0.05);各浓度组之间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。以相同浓度脂多糖刺激S100A8沉默组和阴性对照组细胞,阴性对照组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α浓度均高于S100A8沉默组(P<0.05)。结论:S100A8 siRNA通过下调NR8383细胞中S100A8基因的表达,减轻了脂多糖诱导的炎症介质的释放,有望作为炎症疾病治疗的潜在靶点。

瓜蒌薤白汤含药血清抗博来霉素诱导的大鼠肺泡巨噬细胞致纤维化作用及机制研究

目的:探讨瓜蒌薤白汤含药血清抗博来霉素诱导的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383致纤维化作用及其部分机制。方法:首先应用CCK-8法检测瓜蒌薤白汤含药血清对NR8383细胞增殖的影响,接着将NR8383细胞分组。除正常组外,其余各组细胞应用150μg/mL博来霉素(BLM)刺激,其中,BLM组正常培养,其他刺激组中,阳性对照组用2μg/mL的地塞米松(DEX)干预,空白对照血清组分别用5%、7.5%、15%的空白血清作对照,含药血清组分别用5%、7.5%、15%的含药血清干预。结果:BLM刺激后,与正常组比较,部分细胞的形态发生变化,呈长梭形或者纺锤形,出现伪足样改变,类似于成纤维细胞的形态;与BLM组和空白对照血清组比较,瓜蒌薤白汤含药血清干预能显著改善上述现象。结论:瓜蒌薤白汤含药血清能抑制BLM诱导的大鼠肺泡巨噬细胞的纤维化,具有治疗肺纤维化的应用前景。

体外诱导M1型大鼠肺泡巨噬细胞对弓形虫增殖的影响

目的探究体外诱导M1型大鼠肺泡巨噬细胞对弓形虫感染的影响。方法体外用细菌脂多糖(LPS)+干扰素-γ(IFN-γ)诱导大鼠肺泡巨噬细胞极化为M1型,用实时荧光定量PCR方法检测巨噬细胞极化因子的变化,Western blot检测M1型巨噬细胞标志性蛋白诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的变化,进一步使用扫描电子显微镜技术对诱导效果进行鉴定。M1型巨噬细胞与弓形虫共同培养,Diff染色观察其对弓形虫感染增殖的影响。结果与对照组相比,LPS+IFN-γ刺激后,M1型巨噬细胞中相关因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、iNOS、CXCL10 mRNA、CXCL11 mRNA的相对表达量在6h升高(P<0.01),随后下降。Western blot结果显示,正常NR8383细胞不表达i NOS,LPS+IFN-γ刺激后细胞开始表达iNOS,在24h表达最为明显。扫描电子显微镜下观察到LPS+IFN-γ刺激细胞24h后,细胞表面突触增多、变长,细胞体积变大。正常NR8383细胞、M1型大鼠肺泡巨噬细胞分别与弓形虫进行共培养24h,Diff染色后,正常NR8383细胞内可以看到明显弓形虫增殖,而M1型大鼠肺泡巨噬细胞内几乎观察不到弓形虫。结论 M1型大鼠肺泡巨噬细可以明显抑制弓形虫的感染与增殖。

硒镁联合作用对SiO2致肺泡巨噬细胞NO、NOS水平变化的影响

[目的]观察亚硒酸钠(Na2SeO3)与硫酸镁(MgSO4)单独及联合作用对二氧化硅(SiO2)致肺泡巨噬细胞(AM)一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平变化的影响,寻找二者的最佳剂量组合。[方法]采用大鼠肺灌洗法纯化获得肺泡巨噬细胞(1×109个/L),同时加入SiO2及不同浓度的MgSO4溶液、Na2SeO3溶液、Na2SeO3+MgSO4溶液,37℃,5%CO2条件下培养18h后,检测NO含量与NOS活性。[结果]与SiO2组比较,Na2SeO3与MgSO4单独及联合使用在体外均可以降低巨噬细胞NO水平及NOS活性(P﹤0.05),Na2SeO3与MgSO4的交互作用具有统计学意义,且以1.0μmol/LNa2SeO3与1.0μmol/LMgSO4联合作用效果最好。[结论]Na2SeO3与MgSO4二者联合应用在体外可明显降低SiO2粉尘所致AM的NO水平和NOS的活性。

大鼠骨髓来源树突状细胞体外培养体系的优化

目的探讨优化大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)体外培养体系的方法。方法应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant rat GM-CSF,rrGM-CSF)20μg/L和重组大鼠白介素(recombinant rat interleukin,rrIL)-410μg/L诱导分化Lewis大鼠骨髓单个核细胞,获得未成熟DC(immature DC,imDC)。第6日加入终含量为100μg/L的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激细胞成为成熟DC(mature DC,mDC)。用倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表型、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测DC培养上清液中白介素(IL)-12、IL-10的含量,并以Brown Norway大鼠脾脏T淋巴细胞为反应细胞,做混合淋巴细胞反应检测,观察DC刺激T淋巴细胞增殖能力。结果经细胞形态学、流式细胞术及混合淋巴细胞反应三方面鉴定,证实所培养细胞为DC。体外培养第6日,见大量增殖细胞集落,细胞高表达OX62。LPS刺激细胞后,细胞伪足样突起明显增多,细胞逐渐呈半悬浮、悬浮生长,细胞表面高表达主要组织相容性抗原复合体(MHC)Ⅱ类分子和共刺激分子(CD40、CD86)。与imDC比较,mDC分泌IL-10和IL-12显著增加,刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力显著提高。结论通过采用调整rrGM-CSF和rrIL-4的用量等方法优化体外培养体系诱导大鼠骨髓单个核细胞,可分化出大量骨髓源性DC。