黑果枸杞花青素对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡的影响

旨在探究青海柴达木黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)花青素(anthocyanidin,AC)对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡的影响,作者选用H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,设常氧组、低氧组、低氧+黑果枸杞花青素组和低氧+红景天苷(salidroside,Sal)组,采用酶标仪检测其细胞乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)含量、显微镜观察其细胞形态学变化、荧光酶标仪检测其细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、Hoechst33342/PI双染法检测其细胞凋亡程度、流式细胞术检测其细胞凋亡率、qRT-PCR法和Western blot法分别检测细胞凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)及Bcl2相关蛋白(Bcl2-associated X,Bax)在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果表明,与常氧组相比,低氧能极显著增加LDH、ROS含量和细胞凋亡率(P<0.01),极显著下调Bcl2、Bcl-2/Bax比值的mRNA和蛋白表达(P<0.01),极显著上调Bax的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。在低氧条件下,黑果枸杞花青素可显著减少LDH、ROS含量(P<0.05),细胞凋亡率极显著减少(P<0.01),显著上调Bcl-2和Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表达(P<0.05),极显著下调Bax的蛋白表达(P<0.01)。综上可知,在低氧条件下,黑果枸杞花青素可通过降低LDH和ROS含量,上调Bcl2和Bcl2/Bax比值在mRNA水平和蛋白水平的表达,下调Bax的蛋白表达来有效延缓低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞的凋亡,对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞具有保护作用。

黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞抗氧化能力、炎性因子及能量代谢作用的影响

试验旨在探究青海柴达木黑果枸杞花青素(AC)对H9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响,选用H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,设立常氧组、常氧+AC组、低氧组和低氧+AC组,利用ELISA法检测各组细胞中过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、血红素加氧酶-1(HO-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)以及能量代谢相关因子Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶的变化。结果显示,与常氧组相比,常氧+AC组大鼠心肌细胞MDA、TNF-α、IL-6的含量均显著降低(P<0.05),CAT、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶活性显著升高(P<0.05),GSH-Px、SOD活性和IL-10含量均极显著升高(P<0.01);低氧组大鼠心肌细胞GSH-Px、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性显著降低(P<0.05),CAT、SOD、Ca^(2+)-ATP酶活性和IL-10含量均极显著降低(P<0.01),MDA、TNF-α、IL-6含量均极显著升高(P<0.01)。与低氧组相比,低氧+AC组大鼠心肌细胞MDA、TNF-α、IL-6含量均极显著降低(P<0.01),CAT、GSH-Px、SOD、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶活性和IL-10含量均极显著升高(P<0.01)。研究表明,AC能够通过减轻H9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤,增强低氧下心肌细胞的能量代谢,抑制低氧诱导的炎症发生,进而缓解H9c2大鼠心肌细胞的低氧损伤。

TNF-α联合H_(2)O_(2)诱导对大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤的影响

为探究TNF-α联合H_(2)O_(2)诱导对大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤的影响,建立更贴近于心肌细胞氧化应激和炎症损伤模型,采用200μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)作用1 h联合80 ng·mL^(-1)TNF-α作用H9c2细胞12 h,通过CCK-8、ELISA以及流式细胞术等实验,发现氧化应激指标MDA水平增高,抗氧化酶SOD降低,NF-κB信号通路下游炎症相关的蛋白表达和mRNA表达增强。说明200μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)作用1 h联合80 ng·mL^(-1)TNF-α作用12 h共同刺激H9c2细胞,可诱导大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤,其作用机制可能与靶向调控NF-κB信号通路有关。

黑果枸杞花青素对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞增殖的影响

研究通过构建H9c2大鼠(Rattus norregicus)心肌细胞体外低氧模型,检测H9c2大鼠心肌细胞活性、细胞周期以及增殖相关因子CCNT2、CDK9和FOXP1的mRNA和蛋白表达,探究黑果枸杞花青素(Lycium ruthenicum Murry anthocyanins,AC)对H9c2大鼠心肌细胞增殖作用的影响。结果表明,25和50μg·mL^(-1)黑果枸杞花青素诱导24、36和48 h在常氧和低氧条件下均显著提高H9c2大鼠心肌细胞活性(P<0.05),50μg·mL^(-1)添加效果最佳。低氧组中,处于G0/G1期细胞数量显著增加(P<0.05),S期和G2/M期细胞数量显著降低(P<0.05),添加黑果枸杞花青素后G0/G1期细胞数量显著降低(P<0.05),S期和G2/M期细胞数量显著升高(P<0.05)。低氧条件下CCNT2、CDK9和FOXP1的mRNA和蛋白表达均极显著下调(P<0.01),添加黑果枸杞花青素可显著上调CCNT2、CDK9和FOXF1的mRNA和蛋白表达(P<0.05)。可知,黑果枸杞花青素促进CCNT2、CDK9和FOXP1相关因子表达,对低氧下H9c2大鼠心肌细胞增殖活性发挥保护作用,促进H9c2大鼠心肌细胞周期进程,为开发高原动物低氧生产模式下饲料添加剂,提高动物低氧适应性奠定基础。

芝麻素含药血清对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的:观察芝麻素含药血清对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:培养H9C2大鼠心肌细胞,与芝麻素含药血清或空白血清预孵12 h后,加入AngⅡ孵育24 h。MTT法检测心肌细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测BCL-2、BAX、Caspase-3、SOD和p47phox蛋白表达水平,比色法测定细胞总抗氧化能力、细胞内活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量。结果:芝麻素含药血清预孵可显著改善AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡和活力损伤(P<0.05或P<0.01),下调BAX、Caspase-3及p47phox蛋白表达,上调BCL-2、SOD蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。此外,芝麻素含药血清可显著提高心肌细胞总抗氧化能力降低细胞内ROS和培养上清MDA含量(P<0.05或P<0.01)。空白血清对上述指标均无显著影响。结论:芝麻素可显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡和活力损伤,其机制与改善氧化应激状态、调节BCL-2/BAX蛋白表达水平,进而下调Caspase-3蛋白表达有关。

丙泊酚对新生和成年大鼠心肌细胞钙离子移动的影响

目的 观察不同浓度丙泊酚对氯化钾和咖啡因诱发的新生和成年大鼠心肌细胞钙离子移动的影响 ,探讨其心肌抑制作用的可能机制。方法 用Fluo 3AM钙荧光指示剂染色培养的新生大鼠或急性分离的成年大鼠心肌细胞 ,在激光共聚焦显微镜下动态观察使用丙泊酚前及丙泊酚 (5 0 ,2 5 0 μmol/L)预处理后 ,氯化钾和咖啡因诱发的细胞内钙离子浓度的变化。结果 丙泊酚 5 0 μmol/L使氯化钾诱发的新生或成年大鼠心肌细胞内钙荧光强度的峰值下降 ,较对照组有明显差异 (P <0 .0 1 ) ,对新生大鼠心肌细胞的抑制作用较成年大鼠明显。丙泊酚 2 5 0 μmol/L使细胞内钙荧光强度峰值进一步降低。但两种浓度的丙泊酚对咖啡因诱发的两种心肌细胞钙荧光强度的升高均无明显影响 (P >0 .0 5 )。结论 丙泊酚浓度依赖地降低心肌细胞内钙离子浓度 ,与其抑制细胞外钙内流有关 ,它对新生大鼠心肌细胞的抑制作用更强。提示临床上使用丙泊酚作为麻醉剂 ,尤其对小儿麻醉时应有足够重视。

培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志

目的：通过探寻增加培养成年大鼠心肌细胞存活率以及防止再分化的方法,揭示培养成年大鼠心肌细胞存活的形态标志。方法：采用Langendorff系统灌流心脏,胶原酶消化法分离成年大鼠心肌细胞,分3组进行细胞培养：①基础培养液＋凋亡抑制剂;②基础培养液＋5%胎牛血清;③基础培养液＋5%胎牛血清＋凋亡抑制剂。结果：①培养前3天杆状心肌细胞比例逐渐降低,无血清培养组比血清培养组降低程度大。培养前3天凋亡率逐渐升高,无血清培养组比血清培养组凋亡率高,加入凋亡抑制剂对凋亡率无影响。②有血清培养2~3天的成年大鼠心肌细胞闰盘部位伸出伪足,促使细胞贴壁生长;当培养至第6天时,细胞侧面也伸展出贴壁的伪足,细胞丧失杆状形态,横纹消失。而无血清培养的细胞无伪足生成,随着培养时间增加,细胞末端变圆钝,横纹变模糊。凋亡抑制剂对伪足形成率无影响。③培养存活的成年大鼠心肌细胞骨架重排,发生再分化。④血清培养组细胞胞内核间距离随着培养时间的增加而减小,无血清培养组则保持不变。结论：成年大鼠心肌细胞培养至第2~3天时,闰盘部位形成伪足是细胞存活的形态标志,加入血清是伪足形成的必要条件。

缺氧培养下NRF-1基因对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响

目的通过建立NRF-1基因过表达及shRNA干扰大鼠心肌细胞系探究NRF-1基因在缺氧条件下对线粒体膜电位的影响。方法采用RT-PCR克隆大鼠心肌细胞中的NRF-1基因并将其连接至p CDHMCS-EF1-Puro慢病毒载体,以p CDH-MCS-EF1-Puro空质粒作为对照,同时设计并合成干扰慢病毒载体;将重组质粒与包装质粒一同转染293T细胞,收集病毒颗粒后感染H9c2细胞并通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株;在1%O2、5%CO2、94%N2条件下培养转染的细胞株48h,使用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测线粒体膜电位。结果获得NRF-1过表达细胞株、空载体细胞株及shRNA干扰细胞株;缺氧条件下三组细胞存活率均减弱,与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达组细胞活力较高,shRNA干扰组的细胞活力最弱;另外,流式细胞术检测线粒体膜电位发现缺氧培养后线粒体膜电位下降。与空病毒组细胞相比,NRF-1过表达细胞株线粒体膜电位下降较轻,shRNA干扰细胞株线粒体膜电位下降最明显。结论说明大鼠心肌细胞通过NRF-1基因的过表达可以减缓由缺氧造成的线粒体膜电位的下降,提高细胞在缺氧条件下的存活能力。

大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响

采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。

整合素连接激酶高表达对新生大鼠心肌细胞增殖的影响

背景:整合素连接激酶在调节细胞生存、抗凋亡以及促进细胞迁移、增殖、分化等方面发挥重要作用。目的:观察整合素连接激酶在新生大鼠心肌细胞内高表达后对心肌细胞增殖能力的影响。方法:取新生3d内SD大鼠心脏,体外分离、培养心肌细胞72h后,分别转染重组腺病毒载体或重组腺病毒载体+整合素连接激酶基因。结果与结论:转染48h,与转染重组腺病毒载体比较,转染重组腺病毒载体+整合素连接激酶基因的新生大鼠心肌细胞内DNA合成增加(P<0.05),有丝分裂增多(P<0.05),心肌细胞数量增多(P<0.05)。在整合素连接激酶的作用下,新生大鼠心肌细胞的增殖能力明显提高。

MCSCs-exosomes对成年大鼠心肌细胞缺氧损伤的干预作用

目的探讨来源于骨髓源性心肌干细胞的外切体(MCSCs-exosomes)对成年大鼠心肌细胞体外缺氧损伤诱导凋亡的干预作用。方法将体外培养的成年大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组和MCSCs-exosomes预处理组。随后进行形态学观察、细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测凋亡率的变化。结果与对照组相比,缺氧组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),凋亡细胞比例明显增多。而MCSCsexosomes预处理组可明显改善缺血缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,降低凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论 MCSCs-exosomes预处理可以明显改善体外培养缺氧损伤诱导的成年大鼠心肌细胞的凋亡情况,其机制可能是通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。

左卡尼汀对波动性高糖处理大鼠心肌细胞脂联素受体表达影响的实验研究

目的探讨左卡尼汀（L-carnitine,L-CN）对波动性高糖处理大鼠心肌细胞（rat myocardial cell,RMC）脂联素受体（AdipoR1和AdipoR2）表达的影响。方法将RMC在高糖（20 mmol/L）、波动性高糖培养液（5.5 mmol/L和20 mmol/L每隔8 h轮换1次）中培养5 d后,随机分为正常组、高糖组、波动性高糖组、波动性高糖＋L-CN处理组（102、2.5×102、5×102、103、104、105及106μΜ）。运用细胞增殖试验（CCK8法）检测细胞存活率,依据细胞增殖试验的结果,将分组调整为阴性对照（正常组）、阳性对照（波动性高糖组）、波动性高糖组＋L-CN处理组（102、2.5×102、5×102、103及104μΜ）,应用实时荧光定量PCR方法检测AdipoR mRNA表达的改变。结果与正常组相比,高糖组心肌细胞OD值降低不明显;波动性高糖组心肌细胞OD值减小,与正常组比较差异有显著性（P〈0.05）。提示波动性高糖组对细胞的损害作用明显高于单纯高糖组。L-CN（5×102μΜ）处理组较波动性高糖组OD值增加,差异有显著性（P〈0.05）;L-CN（2.5×102、103及104μΜ）处理组较波动性高糖组OD值增加,差异无显著性（P〉0.05）;L-CN（105μΜ和106μΜ）处理组较波动性高糖组OD值下降,提示左卡尼汀的作用浓度在102~104μΜ之间。L-CN处理后RMCs AdipoR1 mRNA、AdipoR2mRNA均明显增高（P〈0.01）,当L-CN工作浓度在5×102μΜ时,AdipoR表达增加更明显。结论波动性高糖与单纯高糖相比对细胞的损害作用更强,左卡尼汀可在一定程度上降低波动性高糖引起的细胞损害作用,且药物有效浓度在102~104μΜ之间。在波动性高糖环境中,RMC AdipoR mRNA表达下调（P〈0.01）,左卡尼汀能明显上调波动性高糖处理后大鼠心肌细胞AdipoR mRNA表达（P〈0.01）,从而为L-CN类药物更广泛应用于糖尿病心肌病变提供了新思路和新证据。

熊果酸对过氧化氢诱导大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用

目的观察熊果酸(ursolic acid,UA)对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠心肌细胞氧化应激损伤模型的保护作用,并探讨其作用机制。方法冷消化法原代培养SD大鼠心肌细胞,3 d后将细胞随机分为5组:正常对照组、H2O2模型组、UA低(2.5μM)、中(5μM)、高(10μM)浓度组。UA预处理心肌细胞后,加入H2O2作用,分别检测心肌细胞存活率、LDH、CAT、SOD的变化,ROS的水平。结果 UA低、中、高浓度组对比模型组OD值明显降低,LDH含量明显下降,CAT、SOD活性升高,ROS水平下降,且P<0.05。结论 UA对大鼠心肌细胞氧化损伤具有保护作用,可减轻氧自由基对心肌细胞的氧化损伤。

左卡尼汀升高大鼠心肌细胞脂联素受体表达具明显时间依赖性

目的:探讨左卡尼汀(L-carnitine,L-CN)升高波动性高糖处理的大鼠心肌细胞(rats myocardial cells,RMC)联素受体(AdipoR1和AdipoR2)的作用与L-CN作用时间的关系。方法:将RMC在波动性高糖培养液(5.5、20mmol/L每隔8h轮换1次)中培养5d后,随机分为只加低糖DMEM培养基的正常对照组、高糖组(20mmol/L)、波动性高糖处理组、波动性高糖+L-CN处理组(工作浓度5×102μmol/L刺激4、8、12、24、36、48h)。运用细胞增殖试验(CCK8法)检测细胞存活率,应用实时荧光定量PCR方法检测AdipoR mRNA表达的改变。结果:与波动性高糖组比较,L-CN处理后RMC AdipoR1 mRNA、AdipoR2 mRNA增高并具明显时间依赖性,L-CN(5×102μmol/L)处理24h后AdipoR mRNA增加最明显(P<0.05)。结论:在波动性高糖环境中,RMC AdipoR mRNA表达下调(P<0.05),L-CN能上调波动性高糖处理后心肌细胞AdipoR mRNA表达并具明显时间依赖性(P<0.05)(尤其AdipoR1 mRNA)。从而可能为L-CN类药物在治疗糖尿病性心肌病变时的合理、安全用药提供新思路、新证据。

肿瘤坏死因子-α激活大鼠心肌细胞核转录因子-κB活性

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对大鼠心肌细胞(H9C2)核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响。方法体外培养大鼠心肌细胞(H9C2),以TNF-α刺激,凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测NF-κB活性,Westen blot及Alamarblue法分别检测P65蛋白与细胞增殖。结果 TNF-α刺激后NF-κB活性明显增高,且TNF-α对细胞生长有抑制作用。结论 TNF-α对大鼠心肌细胞(H9C2)的调节作用,部分是通过激活NF-κB信号通路实现的。

甘松挥发油对大鼠心肌细胞及HEK细胞Nav1.5钠电流的影响

目的本实验应用膜片钳技术研究HEK细胞Nav1.5电流频率依赖性阻滞时间恢复过程及甘松挥发油对其影响,以及不同浓度甘松挥发油在不同电压钳位下对大鼠心肌细胞钠内向电流的影响。方法发放两次刺激脉冲,间隔从16 ms到1s,电压钳置在-80～-140 mV,观察3ppm(1:333K)浓度甘松挥发油对HEK细胞Nay1.5电流频率依赖性阻滞时间恢复过程。测定不同浓度甘松挥发油在不同钳位电压下对大鼠心肌细胞内向电流的影响。结果 (1)甘松挥发油比对照组产生电流频率依赖性阻滞时间恢复过程缓慢(对照组33.2±5.77 ms,3 ppm甘松挥发油组52.5±6.08 ms,P<0.01),钠电流抑制随刺激频率脉冲间隔时间缩短(56.50～16 ms)而阻滞加重。对照组阻滞恢复时间开始于19.5 ms,完成于36.5 ms;3 ppm甘松挥发油阻滞恢复时间开始于36.5 ms,完成于56.5 ms。(2)浓度1:20 K(相当于生药3.4 g/L)在钳位电压-100mV时无明显静息阻滞,钳位电压在-80 mV时有明显的内向电流阻滞作用;钳位电压在-100 mV,药浓度达1:1K(68 g/L)时,呈现明显的内向电流抑制。结论 (1)HEK细胞Nav1.5通道电流频率依赖性阻滞恢复与刺激频率,钳置电压高低有关,甘松挥发油能延缓电流频率依赖性阻滞恢复时间过程。(2)不同浓度的甘松挥发油对大鼠心肌细胞在不同钳位电压下对钠内流阻滞影响不同。

稳定高表达TGF-β_1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株。方法利用RNA干扰技术提取p EGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了p EGFP-TGF-β1质粒和p EGFP对照质粒的细胞株分为p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组。结果 p EGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%。RT-PCR结果显示,p EGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1m RNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,p EGFPTGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015)。结论本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究。

ShRNA沉默ROCK1和ROCK2的表达对缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的许多研究表明,心肌细胞的凋亡与心衰和冠心病等心血管疾病关系密切。另外有研究表明,ROCK1(Rho-associated coiled-coil protein kinase-1)和ROCK2的表达下调可抑制某些细胞的凋亡。为此,我们将靶向ROCK1和ROCK2基因的shRNA转染大鼠心肌细胞,以沉默ROCK1和ROCK2的表达,探讨ROCK1和ROCK2在缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法 (1)原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。(2)构建并鉴定靶向大鼠ROCK1和ROCK2基因的重组质粒ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA各3个。(3)用脂质体转染法将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后提取蛋白,用Western Blotting检测ROCK1和ROCK2蛋白的表达量,并筛选出沉默效率最高的shRNA。(4)将沉默效率最高的ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:①空白对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照shRNA组;④缺氧+ROCK1-shRNA;⑤缺氧+ROCK2-shRNA组。缺氧结束后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。(5)转染和缺氧处理后收获细胞,用Western Blotting检测Caspase3、p-PI3K和PI3K的表达情况,用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律,用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用MTS检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。(2)Western Blotting的结果显示,shRNA转染能有效抑制ROCK1和ROCK2基因的表达,其中ROCK1-shRNA1和ROCK2-shRNA2的沉默效率最高。(3).荧光显微镜发现,在转染了ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功。(4)缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(5)全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(6)MTS检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(7)流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(8)Western blotting检测发现,缺氧能导致Caspase3表达升高、p-PI3K表达降低,ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。PI3K表达无明显变化。结论 (1)ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA转染能有效沉默大鼠心肌细胞内ROCK1和ROCK2基因的表达。(2)ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞增殖减弱及凋亡增强的作用。(3)缺氧影响Caspase3和p-PI3K的表达是通过ROCK1和ROCK2介导的。(4)为心衰和冠心病等心血管疾病的治疗提供了一种新的可能途径。

高糖环境下西格列汀对大鼠心肌细胞纤维化过程中转录激活蛋白-1及骨膜蛋白表达的影响

目的探讨在高糖环境下西格列汀对大鼠心肌细胞纤维化过程中骨膜蛋白(POSTN)及转录激活蛋白-1表达(AP-1)的影响。方法将大鼠心肌细胞H9c2复苏后接种于含体积分数10%胎牛血清的改良型洛斯维1640培养基持续培养,并用无血清培养基继续培养使其同步化;将同步化的H9c2细胞分为对照组、高糖损伤组及西格列汀处理组,对照组H9c2细胞予以普通培养液,高糖损伤组H9c2细胞予以葡萄糖浓度为33.0 mmol·L^-1的培养基,西格列汀处理组H9c2细胞予以终浓度为33.0 mmol·L^-1葡萄糖+0.1μmol·L^-1西格列汀的培养基。采用细胞计数试剂盒-8检测细胞活力。酶联免疫吸附试验检测H9c2细胞上清液中Ⅲ型胶原蛋白(COLⅢ)表达水平;免疫组织化学法检测H9c2细胞中AP-1蛋白表达水平;反转录-聚合酶链反应检测H9c2细胞中POSTN和AP-1 mRNA表达水平。结果高糖损伤组和西格列汀处理组H9c2细胞增殖活力均显著高于对照组(P<0.05);西格列汀处理组H9c2细胞增殖活力显著低于高糖损伤组(P<0.05)。高糖损伤组和西格列汀处理组H9c2细胞中COLⅢ表达水平均显著高于对照组(P<0.05);西格列汀处理组H9c2细胞中COLⅢ表达水平均显著低于高糖损伤组(P<0.05)。高糖损伤组和西格列汀处理组H9c2细胞中AP-1表达水平显著高于对照组(P<0.05);西格列汀处理组H9c2细胞中AP-1表达水平显著低于高糖损伤组(P<0.05)。高糖损伤组和西格列汀处理组H9c2细胞中POSTN、AP-1 mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05);西格列汀处理组H9c2细胞中POSTN、AP-1 mRNA表达水平均显著低于高糖损伤组(P<0.05)。结论体外高糖环境可促进大鼠心肌细胞的增殖活力,并使心肌细胞纤维化;西格列汀可通过抑制H9c2细胞中AP-1的过表达下调POSTN的表达,从而减缓纤维化进程,延缓心肌细胞损伤。