上皮-间充质转化在高氧诱导大鼠支气管肺发育不良模型中的作用及机制研究

目的探讨上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在大鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型中的作用及机制。方法实验分为两部分。(1)将48只早产大鼠随机分为常氧组和高氧组,每组24只。高氧组暴露于85%氧气中建立早产大鼠BPD模型,常氧组置于同一室内常压空气中,于实验第1、4、7、14天收集早产大鼠肺组织标本。(2)将大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系(RLE-6TN)随机分为常氧组(常规空气中培养)和高氧组(在95%氧气中培养),分别于高氧暴露后12 h、24 h、48 h收集细胞标本进行检测。使用苏木精-伊红染色法观察早产大鼠肺泡化情况,免疫荧光检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞肺表面活性蛋白C(surfactant protein C,SPC)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的共定位。实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法检测早产大鼠肺组织和RLE-6TN细胞EMT相关mRNA和蛋白表达水平。结果(1)与常氧组相比,高氧暴露7 d开始高氧组早产鼠可见肺泡化阻滞和肺泡结构简单化改变;肺组织中SPC和α-SMA存在明显共定位现象,高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露7 d、14 d时,与常氧组比较,高氧组TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05),SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。(2)高氧暴露24 h、48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC表达减少,α-SMA表达增加;高氧暴露48 h时,与常氧组比较,高氧组SPC、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),TGF-β1、α-SMA、N-钙黏蛋白mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。结论EMT破坏了BPD早产大鼠肺泡上皮细胞之间的紧密连接,造成肺泡结构简单化和发育异常,参与了BPD的发生发展。

鹅不食草挥发油对急性肺损伤大鼠支气管上皮细胞CD54表达的影响

目的:研究鹅不食草挥发油的抗炎作用及其可能的机制。方法:采用油酸合并脂多糖“两次打击”致大鼠急性肺损伤模型,观察鹅不食草挥发油对大鼠急性肺损伤的保护作用。结果:鹅不食草挥发油能显著抑制急性肺损伤所致大鼠肺水肿及中性粒细胞升高,抑制肺损伤大鼠支气管上皮细胞中CD54的表达。结论:鹅不食草挥发油对大鼠急性肺损伤有明显的保护作用,减少支气管上皮细胞CD54的表达是其抗吸呼道炎症作用的可能机制。

胆红素对被动吸烟大鼠支气管上皮细胞表达ICAM-1的影响

支气管上皮细胞通过表达细胞间黏附分子介导中性粒细胞向炎症气道聚集参与熳性气道炎症。胆红素是一种有效的抗氧化剂。研究证实，胆红素对急性肺损伤的肺组织有较好的保护作用，本研究旨在观察胆红素对被动吸烟大鼠支气管上皮细胞表达ICAM-1的影响。

枇杷叶三萜酸对慢性支气管炎大鼠气道上皮细胞NF-κB和ICAM-1表达的影响

目的 研究枇杷叶三萜酸（Triterpene acids of Loqnat．Leaf，TAL）对慢性支气管炎（chronic bronchitis，CB）大鼠支气管粘膜上皮细胞NF—κB和ICAM-1蛋白表达的影响，并探讨其可能机制。方法雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、CB模型组、TAL用药（（50，150，450mg·kg^-1））组和阳性药（桂龙咳喘宁，1000mg·kg^-1）组，每组10只。采用卡介苗尾静脉注射联合脂多糖气管内注入的方法建立大鼠CB模型，造模1周后按上述剂量培给药：连续给药2周后，光镜下观察各组大鼠气管病理形态学变化，免疫组化法结合半定量图像分析技术观察各组大鼠支气管粘膜上皮细胞NF—κB、ICAM-1的蛋白表达情况。

GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达

研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件.

桑苏饮对哮喘模型大鼠气道重塑及肺组织上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨桑苏饮对哮喘发作期大鼠的疗效及作用机制。方法:雄性Wistar大鼠90只按随机数字表法分为6组:空白组,桑苏饮高剂量组、中剂量组、低剂量组,定喘汤组,模型组,每组15只。哮喘模型参照文献方法复制,观察治疗前后大鼠一般生活状态、肺组织形态学变化,免疫组化法测定细胞间黏附分子-1(ICAM-1)。结果:治疗后大鼠一般生活状态、肺组织形态学变化各治疗组较模型组皆有显著性差异,尤以桑苏饮低剂量组及定喘汤组疗效较好。桑苏饮不同剂量组间比较,低剂量组较高、中剂量组肺组织上皮细胞ICAM-1表达明显下调,有非常显著性差异(P<0.01)。结论:低剂量桑苏饮能减轻嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,下调哮喘模型大鼠肺组织上皮细胞ICAM-1的表达,从而有效控制气道炎症,改善气道重塑。

内皮素-1在慢性低氧高二氧化碳大鼠支气管中的定位表达

目的 :观察内皮素 1(ET 1)在慢性缺氧高二氧化碳大鼠支气管中的表达及分布 ,认识慢性缺氧高二氧化碳环境与ET 1表达、分布的关系。方法 :用原位杂交技术 ,对慢性缺氧高二氧化碳大鼠支气管中的ET 1的表达进行定位研究。结果 :ET 1mRNA在慢性缺氧高二氧化碳大鼠的支气管上皮细胞和平滑肌细胞中广泛表达 ,特别是在Clara细胞和神经上皮小体的游离面胞浆中均呈强阳性染色。结论 :慢性缺氧高二氧化碳大鼠支气管中ET 1mRNA主要定位于Clara细胞和神经上皮小体的游离面胞浆。缺氧高二氧化碳可能是刺激ET

H_2O_2致大鼠RTE细胞系氧化应激作用及GSH保护作用的体外研究

许多具有氧化作用的空气污染物,均能使细胞产生氧化损伤,使胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)含量上升。而TSLP是一种启动过敏性炎症的重要因子,会导致哮喘等疾病发生率的上升。在本研究中用过氧化氢(H_2O_2)模拟具有氧化作用的空气污染物进行染毒,研究细胞氧化应激水平的变化,并讨论还原型谷胱甘肽(GSH)对细胞受氧化损伤的保护作用。将大鼠支气管上皮细胞(RTE)分组培养,每组设置6个平行实验,分别用低、中、高剂量H_2O_2染毒3 h;高剂量设置1个重复,作为保护组,在染毒前用GSH保护2 h。结果显示,高剂量组H_2O_2(3.2 mmol·L^(^(-1)))染毒的细胞,其细胞活力下降(P<0.01),丙二醛(MDA)水平上升(P<0.01),TSLP水平上升(P<0.05),与之相比,用GSH保护后的同剂量染毒组,上述指标得到全面缓解(P<0.01)。这表明高浓度的H_2O_2会损伤细胞活力,并使MDA及TSLP水平上升,而GSH对TSLP及MDA的升高有极显著的抑制作用,即对细胞有一定的保护作用。

平喘颗粒对气道上皮细胞自噬及凋亡的抑制作用探讨

目的观察平喘颗粒含药血清对气道上皮细胞自噬及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用平喘颗粒(0.54 g/mL)灌胃大鼠3 d,制备含药血清。将对数生长期的16HBE贴壁细胞完全随机分为正常对照组(正常培养基细胞)、雷帕霉素组、雷帕霉素加氯喹组、雷帕霉素加中药组,除对照组,其余各组分别加入雷帕霉素800μL,对照组加入等量DMEM不完全培养液,诱导12 h后弃去培养基,重新将对照组、雷帕霉素组分别加入800μL DMEM不完全培养液,雷帕霉素加氯喹组加入800μL氯喹溶液,雷帕霉素加中药组加入800μL含中药血清,再次培养24 h。电镜观察细胞自噬、流式细胞仪测定细胞凋亡、Westen blotting法检测细胞中自噬效应蛋白-1(Beclin-1)、Caspase-3蛋白表达。结果平喘颗粒可以抑制雷帕霉素引起的16HBE自噬,抑制晚期凋亡率和总凋亡率(P<0.05),平喘颗粒组Beclin-1、Caspase-3的表达得到抑制(P<0.05)。结论平喘颗粒可以保护16HBE细胞,抑制其凋亡率、自噬数量、Caspase-3以及抑凋亡蛋白Beclin-1的表达。

核因子-κB及单核细胞化学趋化蛋白-1在慢性阻塞性肺疾病大鼠中的表达

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)及其调控的单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型中的表达。方法:36只Wistar大鼠随机分为空白对照组、COPD组、布地奈德治疗组和茶碱治疗组,每组9只;用ELISA法检测各组大鼠外周血单个核细胞(PBMC)NF-κB和MCP-1的表达水平,用免疫组织化学染色和原位杂交技术检测各组大鼠细支气管上皮细胞NF-κB和MCP-1的表达水平。结果:(1)COPD组大鼠PBMC中NF-κB和MCP-1水平以及细支气管上皮细胞NF-κB核染色阳性细胞百分比、MCP-1mRNA和蛋白表达明显高于正常对照组;(2)布地奈德治疗组和茶碱治疗组大鼠PBMC中NF-κB、MCP-1水平以及细支气管上皮细胞NF-κB核染色阳性细胞百分比、MCP-1mRNA表达和蛋白表达明显低于COPD组。结论:NF-κB基因及其调控蛋白MCP-1参与了COPD的发病过程,用激素和茶碱治疗后可延缓COPD的发展。

胆红素对烟雾暴露大鼠支气管上皮细胞结构和基质金属蛋白酶9表达的影响

支气管上皮细胞长期受烟雾中的氧化剂等有害物质损伤时，可产生气道及其周围组织的慢性炎症，导致气道结构改变，表现之一为细胞外基质（ECM）结构重塑。基质金属蛋白酶的表达失衡，与ECM代谢紊乱密切相关。近年来发现胆红素既是体内有潜在毒性的代谢产物，也是一种有效的抗氧化剂，对某些组织具有保护作用。我们在吸烟大鼠肺气肿模型建立过程中进行胆红素干预，观察胆红素对吸烟大鼠支气管黏膜的保护作用，以及对支气管上皮细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响。

支气管肺发育不良新生鼠肺上皮细胞标志物的表达及意义

目的研究在新生鼠支气管肺发育不良（BPD）发生、发展中肺泡Ⅱ型肺上皮细胞（AT2）标志物肺表面活性物质c（SPC）、E-钙黏白（E—cad）及问质细胞标志物N-钙黏蛋白（N—cad）、α-平滑肌肌动蛋白（仅-SMA）mRNA及蛋白动态表达变化，阐明肺上皮向间质转化（EMT）在BPD新生鼠肺发育障碍中的意义。方法建立高体积分数氧暴露致新生鼠BPD模型（BPD组），以同样数量且暴露于空气中的新生鼠作为对照（对照组），2组于出牛第3、7、14、21天采集肺组织标本，采用放射状肺泡计数（RAC值）、肺泡间隔厚度、肺泡面积／N分隔面积（A／S）评价肺泡发育，分别应用实时荧光定量PCR（realtimePCR）及Western—blot，检测AT2中上皮细胞标志物SPC、E—cad和间质细胞标志物N—cad、d—SMA的mRNA及蛋白表达水平。结果对照组和BPD组新牛鼠RAC值、肺泡问隔厚度和A／S在第7、14、21天，对照组RAC值（7．38±0．92、9．25±0．70、9．88±0．99）和A／S（2．53±0．02、3．34±0．09、3．96±0．13）均高于BPD组RAC值（5．88±0．83、5．14±0．83、4．38±0．52）和A／S（1．88±0．03、1．95±0．03、1．89±0．02）（P均〈0．05），而BPD组肺泡间隔厚度（8．53±0．04、10．75±0．46、13．55±0．84）明显大于对照组（5．77±0．09、4．40±0．12、3．67±0．18）（P均〈0．01）。第7、14、21天，对照组肺组织的E—cad的mRNA（2．43±0．60、2．59±0．48、3．37±0．53）及蛋白（18．39±1．77、18．29±1．52、11．48±1．72）的表达水平明显高于BPD组（mRNA：1．48±O．55、1．57±0．48、1．12±0．45；蛋白：9．50±1．38、8．57±1．06、8．22±1．31）（P均〈0．05），而SPC表达明显低于BPD组（P均〈0．05）；第7、14、21天，BPD组间质细胞标记物N—cad、α-SMA明显高于对照组（P均〈0．05）。结论在BPD肺泡发育不良阶段，上皮细胞标志物水平下调（E—cad），间质细胞标志物水平上调，提示EMT可能参与了BPD发生过程。

支气管肺发育不良新生鼠模型肺泡上皮细胞标志物的表达变化及意义

目的研究高氧致支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）新生鼠模型中Ⅰ型肺泡上皮细胞（type Ⅰ alveolar epithelial cells，AECⅠ）和Ⅱ型肺泡上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cells，AECⅡ）特异性标志物表达变化及其意义。方法80只新生Wistar大鼠，于生后12h内随机分为模型组（吸入氧浓度为85％）和对照组（吸入空气），每组40只。于暴露第7、14、21天，分别进行肺组织HE染色观察病理学改变，免疫荧光双标染色观察AECI标志物水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）及AECⅡ标志物表面活性蛋白C（surfactant protein C，SP—C）表达及定位，Western blot方法检测AQP5和SP—C的蛋白表达水平，real—time PCR方法检测AQP5和SP—C的mRNA表达水平。结果模型组大鼠肺组织表现出肺泡数目减少，体积增大，结构简单化，肺泡间隔增厚，次级分隔减少等肺泡化障碍表现。免疫荧光双标染色可见，模型组AQP5及SP-C表达明显增多，表达位置紊乱，且双染细胞／SP—C阳性细胞的比例明显增高（P〈0．001）。与对照组比较，模型组中AQP5及SP-C蛋白表达从高氧暴露7d开始增加，增高的趋势持续至21d。模型组中mRNA表达水平，AQP5从暴露7d开始，SP-C从14d开始较对照组明显升高（P〈0．05），且两组间差异随高氧暴露时间延长更加明显（P〈0．05）。结论暴露高氧中的新生鼠BPD模型肺组织中，AECⅠ标志物AQP5及AECⅡ标志物SP-C均表达上调，发生转分化的AECⅡ明显增多，表明在BPD肺损伤后的修复中存在AECⅡ过度转分化现象。

氡染毒大鼠气管-支气管上皮细胞的基因差异表达

氡（Radon）及其子体的致癌效应已引起广泛的关注，被国际癌症研究机构列入室内重要的致癌物质。Meta分析结果提示，氡暴露使矿工发生肺癌的危险陛增高。本研究通过抑制性消减杂交（supprssion subtractive hybridization，SSH）方法，筛选氡染毒大鼠模型的气管．支气管上皮细胞差异表达基因，为探讨氡及其子体致肺癌的早期分子机制提供依据。

低氧对肺动脉高压大鼠肺组织尾加压素Ⅱ合成及释放的影响

目的:探讨低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中尾加压素Ⅱ的合成、分泌及其在低氧性肺动脉高压病理生理过程中的作用。方法:实验选用雄性Wistar大鼠76只,随机分为正常对照组,低氧10,20,30d组,每组19只,在低氧10d和20d后各有1只死亡。间断常压低氧方法复制低氧性肺动脉高压大鼠模型,应用光镜、免疫组化、放射免疫分析等方法,测定低氧各组和对照组大鼠肺组织中尾加压素Ⅱ蛋白表达及血浆、支气管肺泡灌洗液尾加压素Ⅱ含量的动态变化。结果:各组大鼠支气管黏膜上皮细胞、肺血管内皮细胞及其平滑肌细胞、肺巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和支气管软骨细胞中尾加压素Ⅱ均呈阳性表达,低氧后上述各种细胞中尾加压素Ⅱ表达明显增强。血浆和支气管肺泡灌洗液尾加压素Ⅱ浓度于低氧10d开始升高(4.26±1.61),(20.93±6.64)pmol/L,20d时两者均达高峰(9.03±1.80),(34.71±5.31)pmol/L明显高于对照组(3.74±1.08),(16.83±4.99)pmol/L(t=6.15,7.39,P<0.001),低氧30d出现下降趋势,但仍高于对照组(t=2.24,3.97,P<0.05)。结论:低氧可促进肺组织中尾加压素Ⅱ的合成和释放;在低氧性肺动脉高压病理生理过程中,尾加压素Ⅱ对调节肺循环和肺通气及肺血管改建等方面发挥重要作用。

不同急性肺损伤大鼠模型Na^+-K^+-ATP酶活性变化及对地塞米松的反应

目的探讨肺泡上皮细胞膜上Na+-K+-ATP酶在盐酸(HCl)和脂多糖(LPS)两种原因致急性肺损伤大鼠肺水生成中的作用及地塞米松(Dex)治疗肺水肿的意义。方法96只雄性SD大鼠随机分为6组(每组16只):生理盐水对照组(NS组)、NS+Dex组、HCl模型组、HCl+Dex组、LPS模型组、LPS+Dex组,每组又分为支气管肺泡灌洗(BAL)亚组和非支气管肺泡灌洗(NBAL)亚组。NBAL组观察肺组织病理改变、湿干重比(W/D)、Na+-K+-ATP酶水解活性和哇巴因与其受体Na+-K+-ATP酶特异性结合位点数量的变化;BAL组观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞数及蛋白含量的变化。结果①两种模型组Na+-K+-ATP酶水解活性和酶位点数在激素干预前均显著低于干预后水平,并且显著低于对照组水平。②激素干预前两种模型组BALF中细胞总数、PMN分类计数、蛋白含量显著高于干预后水平,显著低于对照组水平。结论Na+-K+-ATP酶在肺水的转运中起重要作用,ALI时肺泡膜上Na+-K+-ATP酶的活性降低可能是产生肺水肿的重要机制之一,地塞米松可以分别增加两种模型组Na+-K+-ATP酶水解活性和位点数;地塞米松可以减轻LPS组肺水肿(以W/D表示)的程度,但对HCl组无效。

地塞米松对支气管哮喘大鼠气道组织中水通道蛋白4表达的影响

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一组与水通透性有关的细胞膜转运蛋白，分布于肺组织的水通道蛋白有6种，参与气道湿化、腺体分泌、水肿形成和重吸收等。支气管哮喘（简称哮喘）常伴支气管黏液分泌亢进，腺体功能的异常。AQP4是否通过影响气道黏膜上皮细胞功能、腺体分泌从而参与哮喘的发病过程，目前国内外尚少见报道。本研究探讨哮喘大鼠AQP4的表达及地塞米松干预后的改变，进一步阐明哮喘的发病机制。

FIZZ1对α-肌动蛋白和Ⅰ型胶原在大鼠支气管哮喘模型中表达的影响

支气管哮喘（简称哮喘）患者的气道慢性炎症可导致上皮细胞损伤，成纤维细胞活化并分化为表达α-肌动蛋白（α-SMA）的肌成纤维细胞和胶原沉积，因此，α-SMA和Ⅰ型胶原是哮喘早期气道重塑中的重要指标。FIZZ1是2000年首次在过敏性炎症中发现的独立新基因。我们试图检测大鼠哮喘模型Ⅱ期肺泡上皮细胞（AECⅡ）中FIZZ1表达水平、肺组织内α-SMA和成纤维细胞内Ⅰ型胶原含量，揭示FIZZ1与早期气道重塑的关系。