TGF-β_(1)对大鼠支气管成纤维细胞IL-6、IL-8及CCL20表达的影响

目的探讨转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))对大鼠支气管成纤维细胞IL-6、IL-8及CC亚族趋化因子配体20(CCL20)表达的影响。方法体外分离培养正常大鼠支气管成纤维细胞,随机分为空白对照组及TGF-β_(1)干预1、2、3组。空白对照组中加入DMEM培养基3 mL,TGF-β_(1)干预1、2、3组分别加入已配好的TGF-β_(1)浓度为5、10、20 ng/mL的含血清DMEM培养基3 mL,分别放入CO_(2)细胞培养箱继续孵育2、12、24、48 h,收集细胞培养物上清,采用ELISA法检测各组支气管成纤维细胞上清中IL-6、IL-8及CCL20。结果TGF-β_(1)干预1组干预2 h时,大鼠支气管成纤维细胞上清中IL-6水平高于空白对照组(P<0.05),其余时段低于空白对照组(P均<0.05);TGF-β_(1)干预1组干预24 h时,大鼠支气管成纤维细胞上清中IL-8水平高于空白对照组(P<0.05),其余时段低于空白对照组(P均<0.05);TGF-β_(1)干预1组干预12、24、48 h时CCL20水平均低于空白对照组(P均<0.05)。TGF-β_(1)干预2组在各时段大鼠支气管成纤维细胞上清中IL-6、IL-8及CCL20水平均低于TGF-β_(1)干预1组(P均<0.05)。TGF-β_(1)干预3组干预2、12 h时支气管成纤维细胞上清中IL-8水平高于TGF-β_(1)干预2组(P均<0.05),之后低于TGF-β_(1)干预2组(P均<0.05);TGF-β_(1)干预3组干预2 h时支气管成纤维细胞上清中IL-6水平高于TGF-β_(1)干预2组(P<0.05),之后12、24 h低于TGF-β_(1)干预2组(P均<0.05),48 h时高于TGF-β_(1)干预2组(P<0.05);TGF-β_(1)干预3组在各时段大鼠支气管成纤维细胞上清中CCL20水平均低于TGF-β_(1)干预2组(P均<0.05)。结论TGF-β_(1)对IL-6及IL-8的释放有诱导作用亦有抑制作用,总体以抑制作用为主,呈时间和浓度依赖性。TGF-β_(1)以浓度和时间依赖的方式抑制大鼠支气管成纤维细胞CCL20表达。

氧化苦参碱对高糖诱导乳鼠原代心肌成纤维细胞转分化的作用及机制

目的探讨氧化苦参碱(OMT)对高糖(HG)诱导乳鼠原代心肌成纤维细胞(CFBs)增殖和转分化的作用及机制。方法Sprague-Dawley(SD)乳鼠20只,取乳鼠心脏的心尖部分分离与培养原代CFBs,取对数生长期CFBs细胞分为空白(Control)组、40 mmol/L甘露醇(Mannitol)组、不同浓度(30、35、40、45及50 mmol/L)HG组及不同浓度(25、50、100、200、400 mg/L)OMT组,采用噻唑蓝比色法(MTT)法检测细胞的增殖情况并确定后续实验OMT的保护浓度;按前述OMT的保护浓度结果,取对数生长期CFBs细胞分为空白(Control)组、40 mmol/L甘露醇(Mannitol)组、40 mmol/L HG(HG)组、40 mmol/L HG+50 mg/L OMT(OMT低剂量)组、40 mmol/L HG+100 mg/L OMT(OMT中剂量)组及40 mmol/LHG+200 mg/L OMT(OMT高剂量)组,采用天狼星红和苏木素-伊红(HE)染色法观察各组细胞的胶原纤维表达及形态变化,采用羟脯氨酸(Hyp)试剂盒检测法和免疫荧光染色法检测各组细胞Hyp及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,采用流式细胞术检测各组细胞的周期分布比例,采用Western blot检测CFBs中α-SMA、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达。结果与HG组相比,50、100及200 mg/L OMT组CFBs细胞活力下降(P<0.05);与HG组相比,50、100及200 mg/L OMT组CFBs细胞形态发生变化,细胞数量变少;与HG组相比,50、100及200 mg/L OMT组CFBs内Hyp含量减少,细胞在S期分布比例降低(P<0.05);与Control组相比,HG组CFBs细胞数量增多,α-SMA表达增多;与HG组相比,50、100及200 mg/L OMT组CFBs细胞数量减少,α-SMA表达减少;与HG组相比,50、100及200 mg/L OMT组HIF-1α、VEGFA、α-SMA、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ及FN表达下调(P<0.05)。结论OMT可抑制乳鼠CFBs增殖并诱导细胞转分化,其机制可能与调节HIF-1α信号相关。

小分子组合诱导大鼠胚胎成纤维细胞重编程为功能性神经元

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞。方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质。结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%。包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%。以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC。其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少。神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少。结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC。

新生与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体蛋白质组学差异分析

目的幼体心脏具有再生修复功能,通过分析新生大鼠与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体的差异蛋白,从分子水平上探讨心肌受损后可能的治疗靶点。方法分别从新生和成年大鼠心脏成纤维细胞中分离出外泌体,并提取蛋白质进行高效液相色谱法(high per-formance liquid chromatography,HPLC)和液相色谱串联质谱法(liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析,鉴定差异表达的蛋白质。使用DAVID数据库对差异表达蛋白基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。并进一步使用STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)分析,以筛选出关键基因。结果在新生大鼠中共发现241个差异表达蛋白,其中上调表达的蛋白有117个,下调表达的蛋白有124个。GO分析显示上调表达基因主要涉及整合素介导的信号通路和对缺氧的反应,而对内肽酶活性负调控的基因下调表达。KEGG分析结果表明上调表达基因主要富集于Hippo信号通路,而下调表达基因主要涉及细胞外基质与受体相互作用。通过PPI分析得出有6个关键基因(Lamc1、Agrn、Itih3、Tfrc、Bgn和Atp5pd)下调,有1个关键基因(Rp17a)上调。结论通过蛋白组学和生物信息学方法,筛选出了新生大鼠和成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体的差异蛋白,以及相关的信号通路和关键基因,为心肌受损精准治疗提供了潜在的靶点。

人脐带间充质干细胞对大鼠肺成纤维细胞分泌Smad2蛋白、结缔组织生长因子的影响

目的探究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程及结局的影响。方法从10只健康雌性无特定病原体级(SPF级)大鼠中提取肺成纤维细胞,用5 ng/mL TGF-β处理大鼠原代肺成纤维细胞的同时,给予不同浓度的hUC-MSCs对其共培养,其中A组(模型组,加入40μL TGF-β)、B组(5×10^(5)hUC-MSCs治疗组,加入40μL TGF-β和1 mL 5×10^(5)个hUC-MSCs)、C组(2×10^(6)hUC-MSCs治疗组,加入40μL TGF-β和1 mL 2×10^(6)个hUC-MSCs)、D组[正常组,加入磷酸盐缓冲液(PBS)40μL],采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞内胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)蛋白表达量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组细胞内结缔组织生长因子(CTGF),Smad2 mRNA的相对表达量。用5 ng/mL TGF-β处理大鼠原代肺成纤维细胞48 h后,将其诱导转化为肌成纤维细胞,再和不同浓度的hUC-MSCs共培养24 h,其中A组(模型组,加入40μL TGF-β)、B组(5×10^(5)hUC-MSCs治疗组,加入1 mL 5×10^(5)个hUC-MSCs)、C组(2×10^(6)hUC-MSCs治疗组,加入1 mL 2×10^(6)个hUC-MSCs)、D组(正常组,不用40μL TGF-β诱导,加入PBS 40μL),采用蛋白免疫印迹法检测各组肌成纤维细胞内CollagenⅠ、a-SMA蛋白表达量;采用RT-PCR检测各组肌成纤维细胞CTGF、Smad2 mRNA的相对表达量。结果在TGF-β诱导的大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中,A、B、C、D组大鼠CollagenⅠ和a-SMA的蛋白表达量均呈现降低趋势(均P<0.05);A、B、C、D组大鼠CTGF和Smad2 mRNA的相对表达量均呈现逐渐降低趋势(均P<0.05);大鼠原代肺成纤维细胞诱导转化为肌成纤维细胞后与不同浓度的hUC-MSCs共培养中,A、B、C、D组小鼠CollagenⅠ蛋白相对表达量和a-SMA蛋白相对表达量均呈现降低趋势(均P<0.05),但A组和B组小鼠CollagenⅠ蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);A、B、C、D组大鼠CTGF和Smad2 mRNA的相对表达量均呈现逐渐降低趋势(均P<0.05),但B组和C组大鼠Smad2 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P<0.05)。结论hUC-MSCs可减少TGF-β诱导大鼠肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中表达Collagen、a-SMA蛋白及CTGF、Smad2 mRNA,降低肌成纤维细胞表达CollagenⅠ、a-SMA蛋白及CTGF、Smad2 mRNA,且高浓度的hUC-MSCs效果最显著。

肌成纤维细胞在高氧致支气管肺发育不良新生大鼠肺组织中的分布特点及表达规律

目的:研究肌成纤维细胞(MF)在高氧致新生大鼠支气管肺发育不良(BPD)肺组织中的分布特点及表达规律,并探讨其在BPD中的作用。方法:将48例新生大鼠随机分为高氧组和空气对照组,建立高氧致新生大鼠BPD的模型,运用免疫组化方法采用病理组织学技术观察BPD过程中MF分布的动态过程及表达规律。结果:高氧组在高氧暴露7 d开始,体重与空气组相比下降(p<0.05),随着高氧暴露时间的延长,体重差异逐渐明显(p<0.01)。对照组α-平滑肌动蛋白(α-SMA)7 d1、4 d时主要表达于次级隔顶端,与弹性蛋白表达部位基本一致,间质少有表达。高氧组7 dα-SMA表达开始增加(p<0.05),表达部位主要在间质,14 d在上述部位表达明显增强(p<0.01),与胶原蛋白表达部位一致。结论:在高氧致在BPD新手大鼠肺组织中,MF不再表达于肺泡分隔的顶端,而主要表达于间质纤维化的部位,并随着暴露高氧时间的延长表达逐渐增强,这与BPD的发展密切相关。

阿托品对大鼠巩膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 探讨不同浓度阿托品对大鼠巩膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 取出生24 h的健康雄性SD大鼠眼巩膜组织(均为右眼)进行原代培养。取细胞进行分组:对照组(正常巩膜成纤维细胞),0.1 g·L^(-1)、1.0 g·L^(-1)及5.0 g·L^(-1)阿托品处理组(正常巩膜成纤维细胞分别加入三种不同浓度阿托品溶液),每组5只大鼠原代培养细胞。加药后24 h, CCK-8法检测各组巩膜成纤维细胞活力,流式细胞仪检测各组巩膜成纤维细胞凋亡率,Western blot法检测各组巩膜成纤维细胞光蛋白聚糖、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-14和MMP抑制剂(TIMP)-2蛋白表达情况。结果 CCK-8实验结果显示:与对照组相比,0.1 g·L^(-1)、1.0 g·L^(-1)及5.0 g·L^(-1)阿托品处理组细胞活力均增高,其中以1.0 g·L^(-1)阿托品处理组增高最显著,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果表明:阿托品处理组各组的巩膜成纤维细胞凋亡率与对照组相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与对照组相比,阿托品处理组巩膜成纤维细胞中光蛋白聚糖、TIMP-2蛋白相对表达量均升高,其中以5.0 g·L^(-1)阿托品处理组上升最明显(均为P<0.05);与对照组相比,阿托品处理组巩膜成纤维细胞中MMP-2、MMP-14蛋白相对表达量均降低,其中以5.0 g·L^(-1)阿托品处理组下降最明显(均为P<0.05)。结论 阿托品处理能增强体外培养大鼠巩膜成纤维细胞活力,这种效应的产生可能与光蛋白聚糖、MMPs、TIMPs等细胞因子有关。

三氧化二砷对支气管哮喘小鼠气道成纤维细胞增殖及原癌基因表达的影响

目的探讨三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)对体外培养的哮喘小鼠气道成纤维细胞(fibroblast,FB)增殖及原癌基因c-myc与c-sis表达的影响。方法实验分为7组,在体外培养的FB中分别加入生理盐水,1μmol地塞米松及浓度为0.25μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L的As2O3,在第1天、第3天、第5天、第7天后用记数法观察FB生长情况,并用流式细胞仪(FCM)检测不同浓度药物对各组FB增殖的影响及各组FB中c-myc与c-sis的阳性表达率。结果各种实验浓度的As2O3对FB均有抑制作用,并有时间及剂量依赖效应。流式细胞仪分析显示,随着As2O3浓度的增高,G1期细胞比例逐渐增高,G2/M期细胞比例降低,浓度为2.0μmol/L、4.0μmol/L的As2O3能显著抑制c-myc与c-sis的表达。结论As2O3能抑制FB的增生,其机制可能与其下调c-myc与c-sis的表达有关。

竹节参总皂苷通过减轻成纤维细胞生长因子21抵抗改善自然衰老大鼠的认知功能障碍

目的探讨竹节参总皂苷对自然衰老大鼠认知功能障碍的改善作用及其相关机制。方法将40只18月龄SD雄性大鼠随机分为模型组、竹节参总皂苷低剂量组、竹节参总皂苷高剂量组、亚精胺组,另取10只5月龄雄性SD大鼠作为对照组。竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠分别给予含有药物的混合饲料(给药剂量为10、30 mg·kg^(-1)),亚精胺组大鼠自由饮用含亚精胺的饮用水(浓度为1 mmol·L^(-1)),连续给药4个月。采用Morris水迷宫实验评价大鼠认知功能;HE染色法检测皮层及海马神经元的病理变化;Nissl染色法检测皮层及海马神经元尼氏体的变化;透射电镜检测皮层线粒体超微结构的变化;Western Blot法检测皮层及海马组织成纤维细胞生长因子21(FGF21)-FGFR1/β-Klotho信号通路相关蛋白的表达。结果与对照组比较,模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.01),目标平台穿越次数、目标象限停留时间均显著减少(P<0.01),首次到达目标平台路程显著增加(P<0.01);神经元损伤明显,尼氏体数目降低,神经元线粒体出现空泡化,嵴排布紊乱;大鼠皮层及海马组织中FGF21蛋白表达水平显著升高(P<0.01),FGFR1、β-klotho、P-ERK蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,竹节参总皂苷高剂量组大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),目标平台穿越次数、目标象限停留时间均显著增加(P<0.01),首次到达目标平台路程显著减少(P<0.01);竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠的神经元损伤明显减轻,尼氏体数目增加,线粒体空泡化、嵴排布紊乱现象消失;皮层及海马组织中FGF21蛋白表达水平显著降低(P<0.01),P-ERK、FGFR1、β-klotho蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论竹节参总皂苷能有效改善自然衰老大鼠的认知功能障碍,可能与通过FGF21-FGFR1/β-klotho信号通路减轻FGF21抵抗,并改善神经元线粒体结构损伤有关。

核苷(酸)类似物联合聚乙二醇干扰素对慢性乙型肝炎大鼠法尼醇X受体-成纤维细胞生长因子19通路、枯否细胞极化的影响

目的 :探究核苷(酸)类似物联合聚乙二醇干扰素对慢性乙型肝炎大鼠法尼醇X受体(FXR)-成纤维细胞生长因子19(FGF19)通路、枯否细胞极化的影响。方法 :选取SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、核苷(酸)类似物(核苷酸)组、聚乙二醇干扰素(干扰素)组、联合组。除正常组外,均采用腹腔注射乙型肝炎病毒进行慢性乙型肝炎建模。建模成功后,对核苷酸组灌胃10 mg/kg拉米夫定,对干扰素组皮下注射5μg/kg聚乙二醇干扰素,对联合组给予拉米夫定联合聚乙二醇干扰素治疗,正常组、模型组同期灌胃同体积生理盐水。酶联免疫吸附法检测血清病毒,全自动生化分析仪检测肝功能,H-E染色法检测肝组织病理形态,免疫印迹法检测FXRFGF19通路蛋白表达,免疫组织化学法检测枯否细胞极化。结果 :与正常组相比,模型组血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)含量、iNOS、CD163阳性表达率显著升高,肝组织FXR、FGF19蛋白表达显著降低。与模型组相比,核苷酸组、干扰素组、联合组血清HBsAg、HBeAg、ALT、AST、TBIL含量、iNOS、CD163阳性表达率显著降低。肝组织FXR、FGF19蛋白表达显著升高,联合组比干扰素组降低显著。结论 :核苷(酸)类似物联合聚乙二醇干扰素,可显著激活FXR-FGF19通路,并抑制枯否细胞M1极化,促进枯否细胞M2极化,对慢性乙型肝炎大鼠具有改善作用。

外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠阴茎肌源性干细胞增殖的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠阴茎肌源性干细胞体外增殖的影响。方法本试验自2020年12月至2021年6月在滕州市中心人民医院精准实验室完成。取健康雄性Wister大鼠5只,体质量(200±50)g,取其阴茎海绵体并采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。取第2代肌源性干细胞分为两组进行培养,实验组:200μl生长培养基+肌源性干细胞,分别用终浓度为10μg/L、30μg/L、50μg/L、70μg/L、90μg/L外源性碱性成纤维细胞生长因子进行干预;对照组:加入200μl生长培养基+肌源性干细胞。分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h加入四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液。应用免疫细胞化学法鉴定大鼠阴茎肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况。统计学方法采用独立样本t检验、Tukey检验。结果(1)肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应[表达量为(79.90±1.82)%],少数呈Desmin阳性反应[表达量为(68.60±0.72)%]。(2)两组肌源性干细胞均随培养时间的延长而明显增殖(均P<0.01),出现显著促增殖效应的培养时间均为96 h。(3)与对照组比较,实验组各浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应;当浓度从10~70μg/L递增时,促增殖作用也随之均显著增强(均P<0.01),至70μg/L时其促增殖作用接近顶峰。结论外源性碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠阴茎肌源性干细胞增殖,且呈浓度-时间依赖性增加,96 h与70μg/L为最佳的体外培养时间和浓度。

SMYD2特异性抑制剂对高糖环境下大鼠肾成纤维细胞活化的影响及其机制

目的:明确赖氨酸甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)特异性抑制剂对体外高糖(HG)环境下大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)活化的影响并探索其可能机制。方法:采用CCK-8法检测SMYD2特异性抑制剂LLY507对体外培养的NRK-49F细胞活力的影响。实验分组为正常糖(NG;含5.5 mmol/L葡萄糖)组、HG(含30 mmol/L葡萄糖)组、NG+LLY507(1.5μmol/L)组和HG+LLY507(1.5μmol/L)组,37℃培养48 h后收集各组细胞蛋白。采用Western blot实验检测SMYD2、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、纤维连接蛋白(fibronectin)、I型胶原蛋白(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、p-Smad3、Smad3、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)p65、NF-κB p-p65、白细胞介素6(IL-6)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)及p-STAT3蛋白水平。结果:LLY507浓度低于1.6μmol/L对NRK-49F细胞的活力无显著影响;与NG组相比,HG组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3,TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著升高(P<0.05);与HG组相比,HG+LLY507组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著降低(P<0.05)。结论:SMYD2特异性抑制剂LLY507可明显抑制HG诱导的NRK-49F细胞活化和细胞外基质分泌,其机制可能与阻断TGF-β1/Smad3、NF-κB和STAT3细胞信号通路激活相关。

人肺和支气管成纤维细胞骨架蛋白的表达和增殖

背景:假设支气管和肺成纤维细胞在损伤修复过程中可能表现出不同的生物学特性,从而在慢性阻塞性肺病气道炎症过程中,支气管和肺组织呈现出不同的重构特点。目的:在体外培养的人肺和支气管成纤维细胞上,观察骨架蛋白的表达以及二者增殖特性的差别,以助阐明慢性阻塞性肺病支气管和肺组织重构的发生机制。方法:采用人肺和支气管成纤维细胞体外培养;免疫组织化学方法测定细胞波形蛋白和肌动蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖。结果与结论:人肺和支气管成纤维细胞均显著表达波形蛋白和肌动蛋白,但两种蛋白在细胞内的分布不同。波形蛋白呈斑点状分布于肺成纤维细胞胞浆内,并以细胞核周围为主;在支气管成纤维细胞内,波形蛋白均匀分布于细胞浆内。在肺成纤维细胞,肌动蛋白沿细胞膜分布;在支气管成纤维细胞,肌动蛋白广泛分布于细胞浆。在相同的培养条件下,支气管和肺组织成纤维细胞的增殖速度不同,支气管成纤维细胞增殖较肺成纤维细胞增殖速度显著增加。提示支气管和肺成纤维细胞增殖修复特性不同,这些生物学特性的差别可能在慢性阻塞性肺病支气管和肺组织不同的重构过程中发挥重要作用。

白介素⁃17A通过自噬调控支气管成纤维细胞胶原降解

目的探讨白介素⁃17A(interleukin⁃17A,IL⁃17A)对大鼠支气管成纤维细胞(bronchial fibro⁃blasts,BF)增殖、自噬及自噬后胶原降解的影响。方法采用酶联合消化法+组织块贴壁法培养BF并鉴定,CCK⁃8法检测细胞增殖能力;实验分组:对照组、雷帕霉素组、雷帕霉素+IL⁃17A组、IL⁃17A组;透射电镜观察细胞自噬泡的形成情况;Western blot检测BF中自噬标记蛋白LC3、p62的表达;ELISA法检测各组中基质金属蛋白酶⁃1(matrix metalloproteinase⁃1,MMP⁃1)与基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP⁃1)的表达。结果IL⁃17A浓度为20 ng/mL时BF细胞增殖能力最佳。IL⁃17A组中自噬泡数量明显减少,LC3⁃Ⅱ/LC3⁃I的比值及MMP⁃1的表达水平明显下调,p62及TIMP⁃1的表达水平明显上调(P<0.05)。雷帕霉素部分逆转了IL⁃17A的作用。结论(1)IL⁃17A可促进BF细胞增殖;(2)IL⁃17A通过抑制自噬,发挥抑制胶原降解的作用,促进气道重塑的发生发展。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4在大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞中的表达

目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在大鼠体内和体外心肌成纤维细胞、心肌细胞中的表达分布及其增龄变化。方法:SD大鼠分为新生组(1~3 d),成年组(17个月)和老年组(22个月),每组8只,其中4只用于冰冻切片,另4只用于PCR;取新生SD大鼠心,酶消化法分离培养原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞。用免疫荧光、免疫组织化学检测原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞HCN4的表达;免疫印迹、实时荧光定量PCR检测原代心肌成纤维细胞HCN4的表达,用实时荧光定量PCR检测不同月龄大鼠心肌组织HCN4的表达。结果:体外细胞培养显示,成纤维细胞和原代心肌细胞中均表达HCN4。组织切片显示,新生、成年和老年大鼠心肌成纤维细胞和部分心肌细胞表达HCN4。P1~P4代成纤维细胞的免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示HCN4随着成纤维细胞代次增加,表达量逐渐降低;不同月龄大鼠左心室的实时荧光定量PCR结果显示随着大鼠月龄增加,HCN4的表达量逐渐降低,其结果与培养的细胞表达一致。结论:HCN4在心肌成纤维细胞和部分心肌细胞中表达。随增龄变化,心肌细胞和成纤维细胞HCN4的表达量逐渐下降。

传染性支气管炎病毒在鸡胚成纤维细胞中适应及复制的生物学特性研究

将传染性支气管郯病毒ＩＢＶ－ＮＨ、Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１适应鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），连续传代获得毒价稳定细胞适应毒并对其生物学特性进行研究。观察了ＩＢＶ致ＣＥＦ细胞病变效应的特征，测定ＴＣＩＤ５０滴度为１０６．０～１０６．０。细胞培养病毒提纯后负染置电镜下进行形态学观察，见到典型的冠状病毒粒子。病毒经胰酶处理显示出血凝特性，该血凝性能被特异性血清所抑制。表明ＣＥＦ细胞病变（ＣＰＥ）确为ＩＢＶ所致。通过对４株ＩＢＶ在ＣＥＦ细胞中最佳培养时间及繁殖量关系的摸索，证实了３６～７２ｈ释放到培养液中有活性的病毒粒子达高峰，ＴＣＩＤ５０最高可达１０７．０／ｍｌ。

苯并(a)芘染毒致人支气管上皮细胞和上皮样成纤维细胞周期的变化

目的:观察苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,BaP]染毒对人支气管上皮细胞(16HBE)和上皮样肺成纤维细胞(W138)细胞周期的影响,并探讨其剂量效应和时间效应。方法:以16HBE和W138细胞未处理组为阴性对照组,二甲基亚砜(DMSO)组为溶剂对照组。分别以不同浓度(1、2、4、8、16、32μmol/L)的BaP染毒16HBE和W138细胞,24 h后用流式细胞术检测细胞周期分布情况;分别以16μmol/L BaP染毒16HBE和W138细胞,作用不同时间后(1、2、4、8、12、24 h)检测细胞周期分布情况;分别以16μmol/L BaP染毒16HBE和W138细胞,作用4 h后,再经过不同时段(0、1、2、4、8、12、24 h)的恢复期后检测细胞周期分布情况。结果:与阴性对照组比较,随着染毒浓度和染毒时间的增加16HBE和W138细胞S期所占比例均增加(P<0.05);16μmol/L BaP染毒16HBE细胞4 h后,经2～12 h的恢复期(正常条件下培养),S期细胞所占比例与刚染毒后细胞(32.43%)相比明显增加(P<0.05),恢复24 h时S期细胞所占比例(24.52%)与阴性对照组(26.41%)相比差异无统计学意义(P>0.05);16μmol/L BaP染毒W138细胞4 h后恢复0～4 h时S期细胞所占比例与阴性对照组(32.42%)相比明显增加(P<0.05),恢复8 h开始减少,24 h时S期细胞所占比例(32.89%)与阴性对照组(32.42%)相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BaP染毒16HBE和W138细胞引起细胞周期分布变化,主要为S期阻滞,G1期和G2期变化不明显。

二甲双胍对糖尿病大鼠创面肌成纤维细胞纤维化的影响及其机制研究

目的探讨二甲双胍对糖尿病大鼠创面修复的促进作用及对真皮层肌成纤维细胞纤维化的影响及其机制研究。方法将18只雄性SD大鼠随机分为正常血糖对照(normal control,NC)组、糖尿病对照(diabetic control,DC)组及糖尿病二甲双胍干预(diabeitic metformin intervention,DM)组。使用高剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射构建糖尿病大鼠模型,在大鼠背部制备直径5 mm全层皮肤创面,DM组大鼠创面用二甲双胍霜剂处理,收集创面及创周组织,通过Western blot和免疫组化染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的表达水平。结果Western blot和免疫组化结果表明,与NC组相比,DC组中α-SMA蛋白表达量下调(P<0.05);与DC组相比,DM组中α-SMA蛋白表达量高于DC组(P<0.05)。与NC组相比,LKB1在DC组中的表达水平降低(P<0.05),与DC组相比,DM组中LKB1的表达高于DC组(P<0.05)。与NC组相比,DC组中TGF-β1的表达低于NC组(P<0.05);与DC组相比,DM中组TGF-β1的表达高于DC组(P<0.05)。结论二甲双胍可以减轻创面真皮层肌成纤维细胞的纤维化,从而促进糖尿病大鼠急性创面的愈合。

基于代谢组学分析碱性成纤维细胞生长因子对糖尿病小鼠肝损伤的作用

目的:基于1H NMR的代谢组学方法探究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在糖尿病肝损伤中的代谢调控作用。方法:将C57BL/6J小鼠设为wt组,db/db小鼠分为糖尿病肝损伤组(db/db组)和bFGF给药组(b FGF组)。给药10周后处死,收集肝脏组织,一部分做HE染色观察肝组织形态,另一部分采集1H NMR谱,采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)比较3组小鼠肝脏的代谢模式变化以及差异代谢物水平。结果:HE染色结果表明,wt组小鼠肝小叶和肝窦结构清晰,db/db组小鼠肝细胞脂肪变性明显,bFGF干预后,bFGF组脂滴和炎性细胞明显减少,细胞坏死损伤减轻。PLS-DA结果表明,3组小鼠肝脏的代谢模式存在明显差异。代谢物定量分析结果显示,db/db组小鼠肝脏中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、琥珀酸、肌酐、甘氨酸、三磷酸鸟苷和苯丙氨酸的代谢水平较wt组显著降低,但给予bFGF治疗后其代谢水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:b FGF可以改善糖尿病肝损伤肝脏组织的代谢紊乱,主要涉及到能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢。

电针调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症反应的研究

目的:观察电针对调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎大鼠滑膜成纤维细胞炎症反应的影响。方法:将16只2月龄大鼠应用随机数字表法分为空白对照组和电针组,每组8只。空白对照组大鼠未接受干预,电针组大鼠予以电针干预,分别制备空白对照组、电针组血清。予以连续酶消化法获取3周龄SD大鼠滑膜成纤维细胞,波形蛋白免疫组化染色进行鉴定;再将6孔板中已培养的滑膜成纤维细胞随机分为空白对照组、模型对照组、电针组成纤维细胞。空白对照组成纤维细胞予以空白对照组血清干预,模型对照组成纤维细胞予以含10 ng·mL^(-1)白细胞介素-1β(IL-1β)的空白对照组血清诱导滑膜成纤维细胞致炎,电针组成纤维细胞予以含10 ng·mL^(-1)IL-1β的电针组血清干预。Real-time PCR检测各组滑膜成纤维细胞中lncRNA NEAT1水平变化;Western blot检测各组滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达含量。结果:经波形蛋白免疫组化染色后,大鼠滑膜成纤维细胞波形蛋白染色为阳性,证实成纤维细胞提取成功。与空白对照组比较,模型对照组中lncRNA NEAT1的相对表达水平显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,电针组中lncRNA NEAT1相对表达水平显著降低(P<0.05)。Western blot结果显示,与模型对照组比较,电针组MMP-3、RELA、TNF-α蛋白表达含量显著降低(P<0.05)。结论:电针可通过调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎大鼠滑膜成纤维细胞炎症反应。