黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及可能机制。方法以大鼠皮质神经元RN-C细胞为研究对象,以缺氧条件(5%CO_(2)、94%N2、1%O_(2))培养24 h,考察不同浓度黄芩素(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)对缺氧RN-C细胞存活率的影响,并检测黄芩素(浓度为0.1μmol/L)对缺氧细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,细胞迁移率、凋亡率和细胞周期,以及对缺氧细胞中活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。结果与对照组比较,缺氧组细胞的存活率显著降低(P<0.01);0.01、0.1、1μmol/L黄芩素可以逆转缺氧导致的细胞存活率降低(P<0.05或P<0.01)。划痕实验显示,黄芩素可显著升高缺氧RN-C细胞的迁移率(P<0.01)。与对照组比较,缺氧组细胞上清液中LDH活性、细胞中MDA含量、凋亡率和G1期细胞比例显著增加,SOD活性、G2+S期细胞比例显著降低(P<0.01);细胞中cleaved caspase-3蛋白的表达量显著上升,Bcl-2/Bax比值均显著下降(P<0.05或P<0.01)。与缺氧组比较,黄芩素组细胞显著逆转了上述指标(P<0.01)。结论黄芩素能促进缺氧条件下大鼠皮质神经元细胞的增殖和迁移,改善缺氧诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞,降低上清液中LDH活性,降低细胞脂质过氧化水平,提高抗氧化水平;其机制可能与调控caspase-3/Bax/Bcl-2通路有关。

脑源性神经营养因子经由环磷酸腺苷反应元件结合蛋白磷酸化对缺氧大鼠胚脑皮质神经元细胞的保护作用

转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Cyclic AMP response element-binding protein，CREB）是胚脑皮质神经元细胞内脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）诱导基因表达的重要调节因子。我们前期的研究表明BDNF对缺氧性神经元损伤具有保护作用，为了阐明BDNF对缺氧性神经元损伤的保护作用是否经过了核蛋白CREB的磷酸化，本研究采用蛋白质免疫印迹法检测单纯缺氧组和BDNF干预组胚脑皮质神经元细胞内CREB及Ser^133磷酸化CREB在不同时间点表达水平的变化。结果显示缺氧及BDNF均能刺激胚脑皮质神经元细胞内Ser^133磷酸化CREB表达增加，在不同缺氧时间点BDNF干预组Ser^133磷酸化CREB表达水平较单纯缺氧组明显增强（P〈0．01），BDNF干预组1h后Ser^133磷酸化CREB表达至高峰，以后持续表达维持6h以上，维持时间较单纯缺氧组明显延长；在缺氧0～3h，BDNF干预组细胞内总CREB表达水平与单纯缺氧组基本一致；随着缺氧时间的延长，单纯缺氧组细胞内CREB表达明显减少，以第5～6h最明显。结果表明，BDNF对缺氧性神经元损伤的保护作用经过了核蛋白CREB的磷酸化。

盐酸非那嗪奈对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

目的探讨盐酸非那嗪奈(fenazinel dihydrochloride,FD)对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及其机制。方法线拴法制备大鼠中动脉局灶性脑缺血(24h)模型。测定脑梗死面积;检测缺血组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、乳酸(LA)含量;观察组织病理学改变。制备大鼠原代神经元细胞撤血清损伤模型及N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)损伤模型,检测FD对损伤细胞死亡率、SOD活性及MDA、LA含量的影响。结果FD可明显降低脑梗死面积,升高组织中SOD活性,降低MDA、LA含量,减轻脑组织病理学损害;在细胞水平上,FD降低损伤细胞死亡率,升高SOD活性,降低MDA、LA含量。结论FD对大鼠局灶性脑缺血损伤具有明显的保护作用,其机制与降低兴奋性氨基酸损伤、清除氧自由基及改善能量代谢有关。

基于H4K16ac介导的细胞自噬探讨电针血清对脑缺血后神经元的保护机制

目的从组蛋白H4第16位赖氨酸的乙酰化(H4K16ac)对细胞自噬调控的角度,研究电针血清对脑缺血后神经元的保护机制。方法电针血清的制备:建立改良的大鼠急性局灶性脑缺血再灌注模型,在造模成功后5 min和16 h进行电针干预,针刺人中、百会穴,并接电针治疗仪治疗30 min。第2次电针治疗后7 h取大鼠血清备用。细胞实验:将大鼠大脑皮质神经元细胞分为对照组、模型组、电针组、组蛋白乙酰转移酶MOF(hMOF)抑制剂组与细胞沉默调节蛋白1(Sirt1)抑制剂组,除对照组外,其余各组剥夺氧、糖3 h后再复氧、复糖24 h,并于复氧、复糖的同时给予2%电针血清、15 g/L的hMOF siRNA及8 g/L的Sirt1 siRNA处理。CCK-8检测细胞处理48 h后细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞处理48 h后细胞凋亡情况;Western blot检测细胞中hMOF、Sirt1、组蛋白H4第16位赖氨酸的乙酰化(H4K16ac)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白Beclin1表达;qPCR检测hMOF、Sirt1、Beclin1 mRNA表达;染色质免疫沉淀技术(ChIP)检测各组神经元细胞的H4K16ac在自噬靶基因Beclin1启动子区的结合程度。结果与模型组相比,电针干预可使细胞增殖活性提高(P<0.05),细胞凋亡率下降(P<0.05)。与模型组比较,电针组和hMOF抑制组剂均可降低hMOF和H4K16ac蛋白的表达(P<0.05),升高Sirt1、LC3-II和Beclin1的表达(P<0.05);而与Sirt1抑制剂组差异无统计学意义(P>0.05)。qPCR结果显示,与模型组比较,电针组和hMOF抑制组剂均可抑制hMOF mRNA表达(P<0.05),而Sirt1和Beclin1 mRNA表达上调(P<0.05)。且与模型组相比,电针组在自噬靶基因Beclin1启动子区域中H4K16ac的富集量增加(P<0.05)。结论电针血清对糖-氧剥夺再灌注损伤神经元细胞具有保护作用,其抗脑缺血再灌注损伤的作用可能是电针通过调节组蛋白H4K16ac的表达进而调控细胞自噬,从而减轻脑缺血再灌注损伤,发挥对神经细胞的保护作用。