多氯联苯对大鼠海马神经元细胞的影响

背景与目的:探讨多氯联苯(polychlorinated biphenyl,PCB)对大鼠海马神经元细胞生长发育的影响。材料与方法:取新生Wistar大鼠双侧海马,无菌条件下制备细胞悬液。实验分为对照组和PCB低(1×10-8mol/L)、中(1×10-7mol/L)、高(1×10-6mol/L)3个剂量实验组。运用光镜、免疫组化技术研究PCB对大鼠海马神经元细胞形态学及bcl-2和TGF-β1表达的影响。结果:PCB对大鼠海马神经元细胞的损伤随着PCB剂量的增加呈升高趋势,高剂量PCB组海马神经元细胞结构改变明显,神经元细胞轴突和树突消失仅部分残存,胞体萎缩;PCB能诱导海马神经元细胞bcl-2和TGF-β1的表达,PCB低剂量组bcl-2呈强阳性表达,中剂量组bcl-2表达显著下调,高剂量组bcl-2为阴性表达;低剂量组TGF-β1表达显著下调,中剂量组TGF-β1表达上调;高剂量组呈阴性,而对照组神经元细胞的bcl-2和TGF-β1均为阳性表达。结论:PCB对大鼠海马神经元细胞的生长产生影响。

脑源性神经营养因子经由环磷酸腺苷反应元件结合蛋白磷酸化对缺氧大鼠胚脑皮质神经元细胞的保护作用

转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Cyclic AMP response element-binding protein，CREB）是胚脑皮质神经元细胞内脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）诱导基因表达的重要调节因子。我们前期的研究表明BDNF对缺氧性神经元损伤具有保护作用，为了阐明BDNF对缺氧性神经元损伤的保护作用是否经过了核蛋白CREB的磷酸化，本研究采用蛋白质免疫印迹法检测单纯缺氧组和BDNF干预组胚脑皮质神经元细胞内CREB及Ser^133磷酸化CREB在不同时间点表达水平的变化。结果显示缺氧及BDNF均能刺激胚脑皮质神经元细胞内Ser^133磷酸化CREB表达增加，在不同缺氧时间点BDNF干预组Ser^133磷酸化CREB表达水平较单纯缺氧组明显增强（P〈0．01），BDNF干预组1h后Ser^133磷酸化CREB表达至高峰，以后持续表达维持6h以上，维持时间较单纯缺氧组明显延长；在缺氧0～3h，BDNF干预组细胞内总CREB表达水平与单纯缺氧组基本一致；随着缺氧时间的延长，单纯缺氧组细胞内CREB表达明显减少，以第5～6h最明显。结果表明，BDNF对缺氧性神经元损伤的保护作用经过了核蛋白CREB的磷酸化。

LncRNA CYTOR对大鼠背脊髓神经元细胞损伤及炎性因子的影响

目的探讨LncRNA CYTOR对大鼠背脊髓神经元细胞损伤及炎性因子的影响及其可能作用机制。方法采用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导大鼠背脊髓神经元细胞建立细胞损伤模型,随机分为:con组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+pcDNA组、H^(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR组、H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC组、H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p组。qRT-PCR检测LncRNA CYTOR、miR-136-5p的表达量;MTT法与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-6、IL-21的水平;双荧光素酶报告实验检测LncRNA CYTOR与miR-136-5p的靶向关系;Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果与con组比较,H_(2)O_(2)组LncRNA CYTOR的表达量降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),miR-136-5p的表达量升高(P<0.05),细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),IL-6、IL-21的水平升高(P<0.05);与H_(2)O_(2)+pcDNA组比较,H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR组细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达及IL-6、IL-21水平均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);LncRNA CYTOR可负向调控miR-136-5p表达;与H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC组比较,H 2O 2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p组细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达及IL-6、IL-21水平均升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论LncRNA CYTOR过表达可通过抑制miR-136-5p表达而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎性反应从而减轻H_(2)O_(2)诱导的大鼠背脊髓神经元细胞损伤。

三七皂苷R1抑制脂多糖诱导大鼠神经元细胞产生一氧化氮

目的 探讨三七皂苷R1对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤)产生一氧化氮(nitric oxide,NO)的抑制作用及其机制.方法 以1μg/mL LPS刺激PC12细胞,24 h后通过Griess法测定计算总NO含量,观察LPS对NO生成的影响.采用WST-1检测LPS和三七皂苷R1对PC12细胞活力的影响,荧光定量PCR和Western blot检测不同浓度三七皂苷R1(25、50μmol/L)对诱导型NO合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA和蛋白表达水平变化.结果 不同浓度的三七皂苷R1在转录水平和翻译水平上都明显地抑制了LPS诱导的细胞炎性蛋白酶iNOS和COX-2的上调,并且其表达呈剂量依赖性(P<0.05).结论 三七皂苷R1对脂多糖诱导大鼠PC12细胞产生NO具有抑制作用,主要是通过抑制iNOS和COX-2表达进而起到抗氧化作用.

清心开窍方对Aβ25-35所致大鼠原代神经元细胞损伤的保护作用

目的:了解清心开窍方对Aβ25-35所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用及其机制。方法:制备17d胎龄大鼠胚胎皮层神经细胞,分为正常对照组、模型组、清心开窍方低、中、高剂量组(6.25、12.5、25 mg·mL-1)。支持培养7 d,除正常组、模型组外,用不同剂量清心开窍方预处理24 h后,连同模型组和终浓度10 umol·L-1的Aβ25-35共同培养,造成神经细胞损伤模型。作用24 h后,以MTT值、培养液乳酸脱氢酶(LDH)水平作为细胞的损伤指标,以线粒体膜电位改变作为凋亡早期指标。结果:清心开窍方可以明显减少LDH漏出,增加MTT值,使低线粒体膜电位细胞的比例减少,抑制细胞凋亡,与模型组比较差异显著(P<0.05)。结论:清心开窍方对Aβ25-35损伤的大鼠原代神经细胞具有保护作用,其机制可能与清心开窍方干预Aβ25-35诱导的细胞线粒体膜电位下降有关。

GSK-3β在大鼠背根神经节神经元细胞内质网应激中的作用机制研究

目的:探讨GSK-3β在大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞内质网应激中的可能机制。方法:将大鼠DRG神经元细胞分为4个组,空白对照组(C组)、衣霉素组(TM组)、衣霉素+GSK-3β抑制剂A014418组(TM+A组)、GSK-3β抑制剂A014418组(A组)。采用2μg/mL TM孵育24 h构建大鼠DRG神经元细胞内质网应激模型。C组不加入药物,TM组、TM+A组培养基中TM浓度为2μg/mL,TM+A组、A组培养基中A014418浓度为10μmol/L。用CCK-8检测法检测各组大鼠DRG神经元细胞活性,实时荧光定量PCR检测大鼠DRG神经元细胞GSK-3βmRNA、内质网分子伴侣BIP mRNA及细胞凋亡相关Bax、Bcl-2mRNA的表达,Western blotting法检测大鼠DRG神经元细胞GSK-3β、p-GSK-3β、BIP及Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:与C组比较,TM组、TM+A组大鼠DRG神经元细胞存活率降低(均P<0.05),BIP、Bax mRNA和蛋白表达上调(均P <0.05),Bcl-2mRNA和蛋白表达下调(均P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达下调,p-GSK-3β/GSK-3β的比值降低(均P<0.05);与C组比较,TM组GSK-3βmRNA表达上调(P<0.05),TM+A组、A组GSK-3βmRNA表达下调(均P<0.05);与TM组比较,TM+A组大鼠DRG神经元细胞存活率明显升高(P <0.05),Bax、BIP mRNA和蛋白表达下调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达上调(均P<0.05),pGSK-3β蛋白表达上调,p-GSK-3β/GSK-3β的比值升高(均P<0.05)。结论:抑制GSK-3β磷酸化,可以减轻由TM诱导大鼠DRG神经元细胞内质网应激反应,减少细胞凋亡。

黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及可能机制。方法以大鼠皮质神经元RN-C细胞为研究对象,以缺氧条件(5%CO_(2)、94%N2、1%O_(2))培养24 h,考察不同浓度黄芩素(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)对缺氧RN-C细胞存活率的影响,并检测黄芩素(浓度为0.1μmol/L)对缺氧细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,细胞迁移率、凋亡率和细胞周期,以及对缺氧细胞中活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。结果与对照组比较,缺氧组细胞的存活率显著降低(P<0.01);0.01、0.1、1μmol/L黄芩素可以逆转缺氧导致的细胞存活率降低(P<0.05或P<0.01)。划痕实验显示,黄芩素可显著升高缺氧RN-C细胞的迁移率(P<0.01)。与对照组比较,缺氧组细胞上清液中LDH活性、细胞中MDA含量、凋亡率和G1期细胞比例显著增加,SOD活性、G2+S期细胞比例显著降低(P<0.01);细胞中cleaved caspase-3蛋白的表达量显著上升,Bcl-2/Bax比值均显著下降(P<0.05或P<0.01)。与缺氧组比较,黄芩素组细胞显著逆转了上述指标(P<0.01)。结论黄芩素能促进缺氧条件下大鼠皮质神经元细胞的增殖和迁移,改善缺氧诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞,降低上清液中LDH活性,降低细胞脂质过氧化水平,提高抗氧化水平;其机制可能与调控caspase-3/Bax/Bcl-2通路有关。

Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型葡萄糖浓度和培养时间的筛选

目的筛选Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型的葡萄糖浓度及培养时间。方法取出生1~3 d Wistar大鼠分离视网膜神经元进行传代培养,尼氏染色法鉴定细胞;实验分5组:A组培养液葡萄糖浓度为0 mmol·L^(-1)(正常对照组),B组浓度为10 mmol·L^(-1),C组浓度为15 mmol·L-1,D组浓度为25 mmol·L^(-1),E组浓度为35 mmol·L^(-1)。分别培养24 h、48 h、72 h后用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果倒置显微镜观察分离培养细胞,大部分细胞于接种24 h后贴壁,少数细胞长出较短的突起,并有向中央聚集生长的现象。2~3 d后长出突起的神经元数目增多,突起长度增加,约为自身胞体长度的1倍。培养5~7 d后神经元突起进一步增多、变长。经尼氏染色后细胞质呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状结构清晰。非神经元细胞胞质基本不着色,细胞核呈淡紫色、圆形,核仁清晰可辨,神经元率达91%。各实验组在培养24 h后OD值均低于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。随培养时间延长OD值继续下降,48 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组OD值明显下降,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05),E组下降更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。72 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。各组在培养24 h后视网膜神经元凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。48 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组凋亡率明显升高,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05);E组凋亡率升高更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01),且与D组比较亦有统计学意义(P<0.05)。72 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05),D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。结论葡萄糖浓度为25 mmol·L^(-1)培养48 h是视网膜神经元高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间。

G-蛋白Rab3a对神经生长抑制因子(GIF)抑制神经元细胞生长作用的影响

为了深入研究Rab3a和神经生长抑制因子(GIF)的相互作用,在大鼠海马神经元细胞原代培养体系中,用MTT还原法定量研究了Rab3a对GIF神经生长活性的影响,发现Rab3a可以替代脑提取物而使GIF发挥神经生长抑制活性.接着又利用多克隆抗体方法研究了GIF与Rab3a的相互作用,结果说明Rab3a是GIF发挥神经生长抑制活性所必需的蛋白质,并且它们的相互作用受空间位置的因素影响较大.在随后对它们相互作用的机理和可能的生物学意义进行了讨论.

盐酸非那嗪奈对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

目的探讨盐酸非那嗪奈(fenazinel dihydrochloride,FD)对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及其机制。方法线拴法制备大鼠中动脉局灶性脑缺血(24h)模型。测定脑梗死面积;检测缺血组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、乳酸(LA)含量;观察组织病理学改变。制备大鼠原代神经元细胞撤血清损伤模型及N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)损伤模型,检测FD对损伤细胞死亡率、SOD活性及MDA、LA含量的影响。结果FD可明显降低脑梗死面积,升高组织中SOD活性,降低MDA、LA含量,减轻脑组织病理学损害;在细胞水平上,FD降低损伤细胞死亡率,升高SOD活性,降低MDA、LA含量。结论FD对大鼠局灶性脑缺血损伤具有明显的保护作用,其机制与降低兴奋性氨基酸损伤、清除氧自由基及改善能量代谢有关。

基于H4K16ac介导的细胞自噬探讨电针血清对脑缺血后神经元的保护机制

目的从组蛋白H4第16位赖氨酸的乙酰化(H4K16ac)对细胞自噬调控的角度,研究电针血清对脑缺血后神经元的保护机制。方法电针血清的制备:建立改良的大鼠急性局灶性脑缺血再灌注模型,在造模成功后5 min和16 h进行电针干预,针刺人中、百会穴,并接电针治疗仪治疗30 min。第2次电针治疗后7 h取大鼠血清备用。细胞实验:将大鼠大脑皮质神经元细胞分为对照组、模型组、电针组、组蛋白乙酰转移酶MOF(hMOF)抑制剂组与细胞沉默调节蛋白1(Sirt1)抑制剂组,除对照组外,其余各组剥夺氧、糖3 h后再复氧、复糖24 h,并于复氧、复糖的同时给予2%电针血清、15 g/L的hMOF siRNA及8 g/L的Sirt1 siRNA处理。CCK-8检测细胞处理48 h后细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞处理48 h后细胞凋亡情况;Western blot检测细胞中hMOF、Sirt1、组蛋白H4第16位赖氨酸的乙酰化(H4K16ac)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白Beclin1表达;qPCR检测hMOF、Sirt1、Beclin1 mRNA表达;染色质免疫沉淀技术(ChIP)检测各组神经元细胞的H4K16ac在自噬靶基因Beclin1启动子区的结合程度。结果与模型组相比,电针干预可使细胞增殖活性提高(P<0.05),细胞凋亡率下降(P<0.05)。与模型组比较,电针组和hMOF抑制组剂均可降低hMOF和H4K16ac蛋白的表达(P<0.05),升高Sirt1、LC3-II和Beclin1的表达(P<0.05);而与Sirt1抑制剂组差异无统计学意义(P>0.05)。qPCR结果显示,与模型组比较,电针组和hMOF抑制组剂均可抑制hMOF mRNA表达(P<0.05),而Sirt1和Beclin1 mRNA表达上调(P<0.05)。且与模型组相比,电针组在自噬靶基因Beclin1启动子区域中H4K16ac的富集量增加(P<0.05)。结论电针血清对糖-氧剥夺再灌注损伤神经元细胞具有保护作用,其抗脑缺血再灌注损伤的作用可能是电针通过调节组蛋白H4K16ac的表达进而调控细胞自噬,从而减轻脑缺血再灌注损伤,发挥对神经细胞的保护作用。