大鼠细小病毒KRV/QD/2022株的分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了解山东地区Kilham细小病毒(kilham rat virus,KRV)的流行情况并探究其分子生物学特征,本试验从某疑似感染KRV的大鼠养殖场分离病毒并对其致病性进行研究。通过观察患病大鼠的临床症状和病理变化并使用PCR方法检测病料确定是否为KRV病毒感染。将阳性病料接种到大鼠神经胶质瘤细胞C6上分离KRV并对其VP2全长测序并构建进化树,通过病毒TCID 50测定、血凝和血凝抑制试验及动物回归试验确定分离株的致病性。结果显示养殖场中流产母鼠子宫体积变小,子宫内胎儿全部死亡或部分死亡。将阳性病料接种于C6细胞上,盲传三代后出现明显病变,对分离株VP2基因进行测序发现该分离株与LG/HN/CHN/2016株相似度最高为98.51%,与其他目前已知分离株的VP2同源性在95.20%~97.31%之间。分离株传到7代后的TCID 50为105.56/0.1 mL,血凝效价为1∶1280,血凝抑制效价为27,证明分离株确为KRV,将其命名为KRV/QD/2022。动物回归试验证明该分离株能感染大鼠并导致大鼠出现流产、繁殖障碍等特征性病变。上述结果显示,本研究成功分离出了一株KRV细小病毒并进行了系统的研究,为该病毒的诊断和预防提供了一定的依据。

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法。根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1、KRV和RMV的引物。结果两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL。双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本。结论本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法。

实验大鼠细小病毒H-1株抗体检测能力验证结果评价

目的了解全国实验动物检测相关实验室在大鼠细小病毒H-1株抗体检测项目的技术水平,发现并解决检验中存在的问题,促进各实验室加强质量管理,提高检测水平。方法不限定检测方法,推荐各参加实验室参照国标规定的方法,对统一发放的大鼠血清样品进行细小病毒H-1株的定性检测,结果以阳性或阴性表示,与预期结果均一致判为满意结果,不完全一致或逾期未反馈结果判为不满意。结果来自13个省市自治区的18家单位报名参加本次比对实验,1家单位因故退出,实际参加并发放比对样品共17家单位,其中16家在规定时间反馈了检测结果,1家未在规定时间反馈结果,反馈结果的16个实验室检测结果均为满意,占参加比对实验室的94%,其中13个实验室使用外购试剂盒,14个实验室采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测,仅2个实验室对阳性结果进行了复检。结论全国各实验动物检测机构大鼠细小病毒H-1株总体检测能力较高,个别实验室因故未参加或逾期未反馈结果,检测能力有待考察。

大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。方法根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物,以H-1和KRV病毒DNA为模板建立双重PCR方法,对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠,分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组,感染后第2,4,6,8,10天采集大鼠粪便,第10天处死所有大鼠,采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织,用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带,敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/m L,最低KRV量为0.73 pg/m L;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出,特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸,感染大鼠均无明显临床症状,感染第10天采集组织,H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8),肝50%(4/8),脾62.5%(5/8),肺50%(4/8),肾37.5%(3/8),盲肠内容物62.5%(5/8),且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8),肝25%(2/8),脾87.5%(7/8),肺12.5%(1/8),肾25%(2/8),盲肠内容物62.5%(5/8),混合感染组检出率高于单独感染组。结论建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。

检测大鼠细小病毒抗体的ELISA、IEA和HI法比较

对检测大鼠细小病毒(RV株)抗体的ELISA、IEA和HI三种方法作了比较。ELISA、IEA和HI法的重复性分别为92.5％、88.2％和68.6％。经对同一批血清检品的检测,ELISA法IEA和检测结果的符合率为90.5％,抗体阳性检出率均为81％,而HI与前两法的符合率均仅为69％,抗体阳性检出率为69％。以上结果表明:ELISA和IEA法在重复性和抗体阳性检出率方面均优于HI(P<0.05)。经ELISA法检测,普通级大鼠中RV抗体阳性率达59％,而在清洁级大鼠中仅为7％。

细小病毒非结构蛋白转基因小鼠模型建立

将小鼠乳腺癌病毒启动子控制的细小病毒非结构蛋白基因(长5.7kb)氯化铯超速离心,纯化透析后用显微注射法导入C57BL/SJL F_1小鼠受精卵雄核,植入假孕母鼠输卵管,得成活小鼠15只。抽取鼠尾DNA,对其中10只小鼠作PCR和southern blot鉴定,其中4只(40％)整合有目的基因。对首建者B_6()的8只子代小鼠鉴定,3只(37.5％)整合有目的基因。说明导入的目的基因能传代。

小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠的建立

为探讨小鼠细小病毒（ＭＶＭ）非结构蛋白在ＭＶＭ感染中的抗肿瘤作用，酶切表达质粒ｐＵＬＢ３２３８获取该非结构基因，通过显微注射法接种入小鼠受精卵内制备转基因鼠。共注射受精卵７２０枚，选取存活受精卵２２５枚植入假孕小鼠输卵管，产仔１４只。转基因小鼠尾部组织ＰＣＲ法ＤＮＡ检测证明，其中４只整合靶基因。整合转基因的４只Ｇ０代小鼠与正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠配种均可生产整合靶基因的小鼠。ＲＴ－ＰＣＲ法ｍＲＮＡ检测证明，Ｇ０Ａ６转基因鼠的肺、乳腺、颌下腺组织，Ｇ０Ａ１３转基因鼠的乳腺组织有靶基因转录。这一结果表明，ＭＶＭ非结构基因转基因小鼠模型已建立。

大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立

本研究以大鼠细小病毒(Rat parvovirus,RPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测RPV抗体的间接ELISA方法。通过比对分析大鼠细小病毒不同毒株的VP2蛋白序列,我们筛选出了RPV株VP2蛋白上长度为378 bp的特异性成熟肽序列,随后构建了pET30a原核表达体系,借助His标签对重组表达产物进行纯化,以纯化鉴定后的表达产物为抗原,免疫Balb/c小鼠制备多抗血清并建立检测大鼠细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA方法。结果显示,抗原包被质量浓度为0.28μg/mL,阳性判定标准初步定为OD450≥0.5,与H-1株和KRV株的阳性血清存在一定的交叉反应,批内试验变异系数小于10%。本研究建立的RPV VP2-iELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于大鼠细小病毒感染的血清抗体检测。

大鼠微小病毒和细小病毒双重荧光定量PCR检测方法建立

目的建立快速、准确地同时检测和鉴别大鼠细小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中已公布的RMV NTU1株全基因组序列(JX627317.1),在1 705～1 808 nt处设计引物和TaqMan探针,根据RPV NTUI毒株的全基因组序列(JX827169),在863-967nt处设计引物和TaqMan探针。以构建的质粒参考物为模板建立荧光定量PCR检测方法,并对该鉴别检测方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对50份临床样品进行检测,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)的商品试剂盒进行验证。结果建立的RMV和RPV的鉴别荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,最低检测限均为10拷贝数/μL;应用鉴别荧光定量PCR方法和ELISA检测试剂盒,对100份大鼠肝脏和50份血清样品病料进行检测,结果均为阴性。结论建立的RMV和RPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏的特点,适用于RMV和RPV的临床监测。

应用转基因小鼠模型研究细小病毒非结构基因抗肿瘤作用

目的探讨小鼠细小病毒非结构基因转基因小鼠抗肿瘤的作用。方法给予肺组织表达非结构（ＮＳ）基因的首建者转基因小鼠Ａ６子代雄性鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯水溶液，以诱发肺瘤结节。给予肩胛皮下不表达ＮＳ基因的Ａ６子代雌性鼠局部注射致癌剂３┐甲基胆蒽苯溶液，以诱发肩胛皮下肿瘤，另一部分子代雌性鼠腹腔接种Ｓ１８０肉瘤细胞２×１０６个／只，使之荷瘤。结果诱发携带ＮＳ基因组小鼠肺瘤结节平均数显著少于未携带ＮＳ基因组（Ｐ＜０．０１）。携带与未携带ＮＳ基因小鼠组的肩胛皮下肿瘤形成率、平均瘤重无显著差异（Ｐ＞０．０５）。腹腔接种Ｓ１８０肉瘤细胞小鼠，携带与未携带ＮＳ基因组的生命延长率无显著差异（Ｐ＞０．０５）。结论表达ＮＳ基因的组织具有抑制化学致癌剂致瘤形成的作用，而不表达ＮＳ基因的组织则无此作用，转基因小鼠对外源性肿瘤细胞的生长无抑制作用。ＮＳ基因可能主要在表达的细胞内发挥作用。

大鼠细小病毒H-1株培养方法的建立

目的建立用大鼠胶质瘤细胞系(Rat glial cell line C6)替代大鼠原代胚细胞(primary rat embryocells,RE)培养大鼠细小病毒(Toolan virus,H-1)的方法。方法 将0.8 mL H-1病毒接种C6细胞(75T培养瓶,细胞接种量为2×105/mL,培养过夜),待细胞病变CPE达++～+++时,用免疫荧光(FITC)鉴定所培养病毒的抗原,用血球凝集试验(HA)测定培养物上清效价,用DNA测序鉴定所培养的病毒,用96孔板培养法测定H-1病毒的TCID50。结果H-1在接种到C6细胞的第3～4天,细胞发生明显的病变,CPE可达++++,FITC鉴定呈H-1抗原阳性,病毒的培养上清中HA效价为1∶320。测序结果表明:该病毒序列与NCBI中H-1序列同源性达99%,确定为H-1病毒。收获的H-1的TCID50为103.2/0.1 mL。结论用大鼠胶质瘤细胞系(C6)可以替代大鼠原代胚细胞(RE)进行大鼠细小病毒的培养。

大鼠细小病毒KRV株培养方法的建立

目的建立用大鼠胶质瘤细胞系(Rat glial cell line C6)替代大鼠原代胚细胞(Primary rat embryo cells,RE)来培养大鼠细小病毒(Kilham Rat Virus,KRV)的方法。方法将500 TCID50 KRV培养物接种到75T-C6细胞培养瓶中(细胞接种量为2×105/mL),培养过夜,待细胞病变CPE达++～+++时,分别用免疫荧光(FITC)鉴定所培养病毒的特异抗原,用血球凝集试验(HA)测定培养物上清的效价,用DNA测序鉴定所培养的病毒,最后用96孔板培养法测定KRV的TCID50。结果 KRV在接种到C6细胞的第4～5天,细胞发生明显的病变,CPE可达++++,FITC鉴定呈KRV抗原阳性,病毒的培养上清中HA效价为1∶5 120,测序结果表明,该病毒序列与NCBI中KRV序列同源性达98%,确定为KRV。收获的KRV的TCID50为104.6/0.1 mL。结论通过对C6细胞系培养KRV方法的标准化和对所培养病毒的一系列鉴定表明,用大鼠胶质瘤细胞系可以替代大鼠原代胚细胞系进行大鼠细小病毒的培养。

大鼠细小病毒检测技术研究进展

大鼠细小病毒是一种DNA病毒,存在多种血清型,分为不同毒株。该病毒可自然感染实验大鼠和野鼠,不同毒株感染后临床症状不一。该病毒可对大鼠的组织或器官造成影响,导致大鼠生理生化参数改变,直接影响实验结果。因此,对感染大鼠的筛选鉴定至关重要。本文旨在系统阐述大鼠细小病毒检测技术的研究情况,对比不同的方法,提出了问题和展望,为实验动物质量控制提供帮助。

B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响

目的探讨B19病毒vplu蛋白是否影响心脏发育及相关机制。方法对不同孕龄母鼠注射B19病毒vplu蛋白,采集胎鼠心脏组织标本,通过光镜、电镜、免疫组织化学、TUNEL和原位杂交技术观察心脏细胞结构变化、细胞凋亡及相关基因或表面标志物变化。结果实验期间有23只小鼠怀孕,vplu蛋白和(或)抗vplu蛋白mAh干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量及鼠心脏重量进行组间方差分析,差异无显著性(P>0.05)。vplu蛋白和(或)抗VPIu蛋白mAl干预组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽,胞质透明淡染,部分心肌细胞脂肪变性。电镜下vplu蛋白(或)和vplu蛋白mAh共同注射组、抗VPIu蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中,有空泡化,并TUNEL免疫荧光和免疫组织化学显示心肌细胞发生细胞凋亡。对照组胎鼠均未见异常。结论B19病毒vplu蛋白与胎鼠流产、心脏发育畸形无关,与胎鼠心脏水肿有关。

抗小鼠白血病病毒单克隆抗体的研制及其初步应用

用密度梯度离心提纯的小鼠白血病病毒（ＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＭｕＬｖ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，采用杂交瘤技术获得６株分泌抗ＭｕＬｖ单克隆抗体的杂交瘤细胞。经检测，它们所分泌的抗体类型分别为ＩｇＭ（Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，Ａ８）和ＩｇＧ１（Ａ９．Ｂ６）。腹水效价为１０－３～１０－５。相对亲和力分别为１．２５ｕｇ／ｍｌ（Ｆ１０），１．３０μｇ／ｍｌ（Ｄ６），１．２０μｇ／ｍｌ（Ｃ１２），１．０μｇ／ｍｌ（Ａ８），０．０７μｇ／ｍｌ（Ａ９），０．００１μｇ／ｍｌ（Ｂ６）．Ｆ１０，Ｄ６，Ｃ１２，和Ａ８能识别相同或相近的抗原表位，Ａ９和Ｂ６识别不同的抗原位点。特异性测定结果表明：６株ＭｃＡｂ与１１种鼠源性病毒抗原脑膜炎病毒（ＬＣＭ）；流行性出血热病毒（ＥＨＦ）；鼠痘病毒（Ｅｃｔ．）；鼠肝炎病毒（ＭＨＶ）；仙台病毒（Ｓｅｎｄａｉ），呼肠孤病毒（Ｒｅｏ３）；鼠肺炎病毒（ＰＶＭ）；细小病毒（ＭＶＭ）；鼠腺病毒（ＭＡｄ）；多瘤病毒（Ｐｏｌｙｏｍａ），脑脊髓炎病毒（ＧＤＶＩＩ）均无反应。将ＭｕＬｖ ＭｃＡｂ标记荧光素应用于实际检测，取得较好的实验结果。

响应面法优化鼠细小病毒悬液制备及滴度测定

[目的]研究鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,同时制备高滴度的MMV。[方法]通过Box-Behnken设计-响应面法优化A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。[结果]A9细胞的最佳接种浓度、病毒培养时间及病毒吸附时间分别为9×10^(3)个/孔、12 d及0 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为0.5时,感染后72 h收获,病毒滴度最高。[结论]Box-Behnken设计-响应面法适用于A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。制备的病毒液的平均滴度为6.35TCID_(50)/0.1 mL。

细小病毒B19壳抗原VP2在大肠杆菌中的表达及血清学检测

为了进行B19感染临床的血清学诊断,利用原核表达载体PQE31克隆和表达B19壳蛋白VP2,酶切鉴定PCR产物及PQE31-VP2克隆的正确性,Western-blot证明表达蛋白的特异性,并对其表达条件和纯化条件进行了优选。在D600为0.7,诱导时间为5h时表达量最高。Ni2+亲和色谱,用0.5mol/L咪唑洗脱液洗脱,获得纯化蛋白。利用纯化蛋白检测100份人群血清,免疫斑点法结果为阳性94例,阴性6例;ELISA结果为阳性84例,阴性16例,两种方法结果一致(0.25>P>0.1)。

猪细小病毒病的诊断与防制

猪细小病毒病是由猪细小病毒引起的一种猪的繁殖障碍病之一。其特征是受感染的母猪,特别是初产母猪产出死胎、木乃伊胎、畸形胎、流产等,有时还可导致公母猪不育,除妊娠母猪外,其它种类的猪感染后均无明显的临床症状,本文就猪细小病毒病的诊断与防制方面做一概述。1流行病学1.1易感动物猪是已知的唯一易感动物,不同年龄、性别的家猪和野猪都可感染。

鼠细小病毒质量对除病毒过滤验证的影响

目的探讨鼠细小病毒(murine minute virus,MVM)质量对于除病毒膜过滤验证的影响。方法利用病毒浓缩试剂盒和Sartobind Q离子交换膜在不同条件下对MVM进行两步纯化。采用滤器Virosart HF和Viresolve®Pro Micro Device,使用纯化的MVM进行2种抗体的纳米膜过滤除病毒验证。结果在2种抗体的纳米膜过滤除病毒过程中,加入两步纯化MVM的样品与未加毒的样品相比通量衰减分别仅从9%增至12%和23%,而加入仅经过病毒浓缩试剂盒纯化的MVM分别从9%增至26%和55%。结论MVM纯度的提高可改善除病毒过滤验证中的通量衰减。

抗肺肿瘤转基因小鼠模型的建立

目的建立抗肿瘤转基因小鼠模型。方法用ＢａｍＨＩ酶切表达质粒ｐＵＬＢ３２３８获取小鼠细小病毒非结构基因，通过显微注射法将其接种入小鼠受精卵内制备转基因小鼠。转基因鼠尾部组织ＤＮＡ以ＰＣＲ检测靶基因整合；整合转基因的Ｇ０Ａ６小鼠与正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠配种所产Ｇ１代转基因鼠，通过ＲＴ┐ＰＣＲ检测目的基因在其肺脏等组织的转录；Ｇ１代鼠根据ＰＣＲ检测结果分整合和未整合非结构基因两组，两组均腹腔注射致肺肿瘤化学致癌剂氨基甲酸乙酯水溶液。结果Ｇ０代有４只鼠整合靶基因；Ｇ１代（Ｇ０Ａ６子代）转基因鼠的肺组织有靶基因转录；Ｇ１代整合转基因实验组小鼠被诱导肺瘤结节平均数显著少于未整合转基因的对照组（Ｐ＜０．０１）。结论抗肺肿瘤转基因小鼠模型已建立。