缺血预处理对大鼠肝移植缺血再灌住损伤后CyclinD_1和CyclinE表达的影响

目的探讨缺血预处理(IP)对大鼠肝移植缺血再灌(IR)注损伤后肝CyclinD1和CyclinE表达的影响,来了解移植肝再生能力和功能不良的影响因素。方法将SD大鼠90只随机分为缺血预处理组(IP)。对照组(OLT)和假手术组(SO)三组;用全自动生化分析仪来检测肝功能;通过免疫组化S-P法来测定移植肝CyclinD1和CyclinE的变化。结果对照组中大鼠移植肝缺血再灌注损伤后血清中谷丙转氨酶(ALT)谷草转氨酶(AST)明显升高,CyclinD1和CyclinE的百分含量较低,提示移植肝细胞再生不良;实验组经缺血预处理后血清中谷丙转氨酶(ALT)谷草氨酶(AST)稍升高,幅度小于对照组,CyclinD1和CyclinE的百分含量很高,提示移植肝细胞再生活跃。结论缺血预处理能够启动内源性保护移植肝的相应机制,可促进肝CyclinD1和CyclinE的合成,激发肝细胞的增殖和再生。

大鼠肝移植模型制作

主要内容：肝移植是治疗终末期肝病的有效手段，通过肝移植，晚期肝病患者可以重获生机。肝移植的相关研究也成为热点。肝移植后病理生理及微循环的观测等基础研究对探索肝移植术后的临床治疗有十分重要的指导意义。所以，动物肝移植模型的建立是必不可缺的。

TGF-β_1与大鼠肝移植免疫耐受的关系

在大鼠不同品系间行肝移植,某些品系的移植肝可以被受体自发性免疫耐受.例如将BN大鼠的肝脏移植到Lewis大鼠中可以发生自发性免疫耐受,但是反过来却发生急性排斥反应.在肝移植的实践中,由于供体的缺乏,促进了劈肝移植(splitting liver transplantation)和活体肝移植(living liver transplantation)的迅速发展.在这两种术式中,均可能发生移植肝与受体体重之比小于正常,该移植物称为"小体积移植物"(small for size).移植后的"小体积移植物"如同肝切除一样发生肝再生现象.已有实验报道,肝再生可以诱导移植后排斥反应.我们的实验也发现,虽然Lewis大鼠能自发性耐受BN大鼠全肝移植后的急性排斥反应,但移植50%体积的BN大鼠却不能.鉴于转化生长因子-β1(TGF-β1)不仅是肝细胞增生中的主要负性调节因子,也是一强有力的免疫抑制因子,本实验研究了TGF-β1在BN和Lewis大鼠肝中的基因表达;移植肝再生中TGF-β1基因表达与排斥反应的关系.

单人直视下大鼠肝移植模型供肝获取不同灌注方式比较

目的单人直视下建立大鼠肝移植模型,并探讨不同灌注方法对供肝质量的影响。方法在Kamada建立的"二袖套法"基础上改进手术细节,建立大鼠肝移植模型。根据不同的灌注方式将受体大鼠分为A(经腹主动脉灌注)、B(经门静脉灌注)两组。比较两组的灌注效果、手术时间、手术成功率、术后肝功能、肝脏移植物病理学表现及生存情况等。结果灌注完成后,B组肝血窦内残留红细胞较A组多。A组在供肝灌注时间及供体手术时间上均较B组时间长,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。A、B两组手术成功率分别为77%和71%。大鼠肝移植术后3 d,两组受体丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TB)水平均较正常值明显升高;术后7、30 d,与A组比较,B组ALT、AST、TB水平均明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01~0.05)。肝脏病理学检查提示B组肝脏炎症反应程度及肝组织破坏程度均较A组严重,但两组的术后长期生存率差异无统计学意义。结论经腹主动脉灌注大鼠肝移植模型虽稍延长了灌注时间及供体手术时间,但灌注效果更佳,可减轻术后肝组织损伤,使肝功能更快地恢复正常水平。

泡状棘球蚴感染纯系大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨感染泡球蚴的大鼠原位肝移植(Orthotopiclivertransplantation,OLT)后免疫系统的变化特点及其对移植物的影响。方法:分为3组:(1)A组为正常对照组(同系移植):健康(Lewis)LEW大鼠→健康LEW大鼠;(2)B组为对照组(非同系移植):健康BrownNorway(BN)大鼠→健康LEW大鼠;(3)C组为实验组:BN大鼠→LEW大鼠(感染泡球蚴后3个月)。术后LEW大鼠存活48h判定为肝脏移植手术成功。每组于术后1、3、5、7d4个时间点各处死2只LEW大鼠,取血清及移植的肝脏、脾脏。每组留8只用于观察生存期。结果:A组、B组、C组受体存活时间平均为(54.13±16.62)d、(4.75±1.58)d、(15.50±3.93)d,差异有统计学意义(P<0.05)。病理结果示:(1)A组无排斥反应现象;(2)B组排斥反应随移植天数的增加逐渐加重,术后1、3、5、7d分别出现0、1、2、3级排斥反应;(3)C组第7天出现1级排斥反应。结论:感染泡状棘球蚴后有利于同种异体移植物的存活;

（动物模型）肝移植免疫耐受的研究以及三维重建技术在肝泡状棘球蚴治疗中的应用：泡状棘球蚴感染对大鼠肝移植物存活的影响及机制探讨

目的探讨泡状棘球蚴感染对大鼠肝移植物存活的影响及其可能的机制。方法建立BN大鼠泡状棘球蚴感染模型，将实验大鼠分为实验组（LEW大鼠→感染泡球蚴3个月的BN大鼠）和对照组（健康LEW大鼠→健康BN大鼠），利川蚁袖套发建立肝移植模型，分别在移植术后第1、3、5、7天取肝脏组织，采用免疫组织化学的方法检测肝移植后排斥反应；采用流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞标志物CD4＋、CD8、CD28＋的表达，利用半定量RT-PCR的方法检测趋化凶子Fractalkine（FKN）的表达。结果实验组移植物存活时间[（15．5±3．93）d]明显长于对照组[（4．75±1．58）d]，差异有统计学意义（P〈0．05）；免疫组化结果示实验组排斥反应较对照组出现较晚且程度较轻；实验组CD4＋、CD8＋及CD28-的表达[（41．35±4．58）％、（21．94士2．61）％、（17．76土4．16）％]较对照组[（51．28±6．36）％、（33．85±3．02）％、（23．08±4．74）％]低，差异有统计学意义（P〈0．05）；实验组FKNmRNA表达较埘照组降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论泡状棘球蚴感染能够延长大鼠肝移植物的存活，泡状棘球蚴感染对宿主免疫系统尤其对效应T淋巴细胞进行抑制是可能的途径之一。

金纳多对大鼠移植肝缺血再灌注损伤后早期保护作用的探讨

目的探讨金纳多对大鼠移植肝缺血再灌注(IR)损伤后早期的保护作用。方法对72只SD大鼠随机分为术前使用金纳多(银杏黄酮配糖体)注射液的分析治疗的预处理组(称IP组)和缺血再灌注组(称IR组)两组,以CycinD1和CyclinE的阳性细胞百分含量作为细胞增殖的分析方法,观察移植肝缺血再灌注损伤后早期的病理变化及细胞增殖情况。结果IP组大鼠移植肝缺血再灌注损伤后血清中谷丙转氨酶(ALT)谷草转氨酶(AST)升高幅度明显低于IR组;肝脏CyclinD1和CyclinE的阳性细胞百分含量远高于对照组,提示缺血再灌注损伤后移植肝细胞增生活跃。结论金纳多对大鼠移植肝缺血再灌注损伤后早期增强细胞增殖能力,抑制细胞凋亡通路的启动。促进移植肝功能修复。对移植肝有保护作用。

改良双袖套法大鼠原位肝移植500例

目的:改进大鼠肝移植的方法,缩短无肝期,提高手术成功率,总结大鼠原位肝移植经验.方法:正式实验分组:(1)预输注供者凋亡的脾细胞正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(2)同期输注供者凋亡的脾细胞对正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(3)术后输注供者凋亡的脾细胞正常大鼠肝移植研究组(分4小组);(4)预输注供者凋亡的脾细胞对肝硬化大鼠肝移植研究组(分4小组);(5)预输注供者凋亡的血液淋巴细胞对正常大鼠肝移植研究组(分3小组),每小组各10只大鼠.观察手术时间以及大鼠肝移植2d和1wk存活率.结果:在正式实验大鼠肝移植中,供体手术时间30±5min,供肝热缺血时间2±0.5min,袖套准备及肝脏修整时间10±2min,受体手术时间51±10min;无肝期16±4min.冷缺血时间61±5min.正式实验大鼠肝移植2d存活率96.8%(184/190),1wk存活率95.3%(181/190).结论:改进显露方法及肝上下腔静脉吻合方法后,手术简化,同时并发症减少,生存率提高.

单人显微操作下大鼠肝移植模型的建立

目的评价新的肝上下腔静脉显微缝合方法、新的袖套和支架制作技术。方法将186只SD大鼠分为4组,前3组予肝移植,每组60只,供、受体各30只;第4组为假手术对照6只。肝移植第1组和第2组采用新的肝上下腔静脉缝合方法+新的单槽袖套,其中第1组采用新的无损胆道支架,第2组采用传统的粗制支架。第3组采用传统的双定点肝上下腔静脉缝合方法+传统的多痕袖套+无损支架。第4组为开腹后仅游离肝周韧带的假手术组。记录肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉的重建时长和无肝期时长,1周和1个月生存率。测定术后1个月肝功能,并明确有无血管扭转、血栓形成和胆汁瘤、胆道梗阻等并发症。结果第1组肝上下腔静脉显微缝合时间为(661±69) s、第2组(662±67) s,第3组(826±73) s,第1组、第2组均较第3组快,差异有统计学意义(P<0.05)。第1组肝下下腔静脉重建时间为(61±12) s,第2组(58±10) s,第3组(72±12) s;第1组门静脉重建时间为(73±11) s、第2组(76±10) s,第3组(91±17) s;第1组、第2组均较第3组快,差异有统计学意义(P<0.05)。第1组无肝期(758±68) s,第2组(760±67) s,第3组(939±73) s,第1组、第2组均短于第3组,差异有统计学意义(P<0.05)。第1组、第3组的胆道并发症发生率低于第2组。第1组、第3组的1周、1个月生存率均高于第2组。结论新的肝上下腔静脉显微缝合方法结合单槽袖套的重建时间短、显著缩短无肝期。无损胆道支架术后并发症更少。

巨细胞病毒感染加速大鼠肝移植慢性排斥反应的进程

巨细胞病毒（CMV）引起移植肝脏受损的机制尚不清楚。我们通过同种异体大鼠肝脏移植慢性排斥反应动物模型的建立，观察CMV感染对慢性排斥反应的损伤效应和对致纤维增生因子转化生长因子-β1（TGF—β1）、血小板衍生生长因子（PDGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响，探讨CMV感染对慢性排斥反应致病的机制。

蛋白转导血红素氧合酶-1对大鼠肝移植辅助性T细胞17／调节型T细胞平衡的影响

本研究旨在观察蛋白转导结构域TAT与血红素氧合酶-1（HO-1）融合蛋白（TAT-HO-1）供肝冷保存对大鼠肝移植辅助性T细胞17／调节性T细胞（Thl7／Treg）平衡的影响。

CD8^+CD45RC^low调节性T细胞在大鼠肝移植自然免疫耐受中的作用机制

目的探讨CD8^+CD45RC^low的调节性T细胞及相关细胞因子在大鼠同种异体原位肝移植耐受过程中的分布规律。方法近交系BN大鼠为供体,雄性Lewis大鼠为受体,双套袖法同种异体原位肝脏移植。实验分为:肝移植短期组10只,肝移植耐受组10只和对照组6只,各组术后常规检测肝功能。苏木精-伊红(HE)染色用于判定移植物达到自然免疫耐受。流式细胞术分析外周血、移植物、淋巴结中淋巴细胞亚群的变化,Luminex技术进行细胞因子定量检测。结果有70%的移植术后大鼠自然免疫耐受。长期耐受组与对照组的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)比较,差异无统计学意义[(456±54)U/ml比(460±151)U/ml,(122±35)U/ml比(121±46)U/ml,P>0.05]。与早期移植实验组比较,在免疫耐受大鼠外周血中CD8+CD45RClowT细胞显著增加,移肝脏局部随着耐受时间的延长其相对含量不断增加;移植物周围淋巴结中该类细胞的表达差异无统计学意义(P>0.05);外周血中pDC在与对照组比较短期组明显增加。移植物局部细胞因子检测发现干扰素(IFN)-γ在早期升高,随后恢复到正常水平;白细胞介素(IL)-10出现持续升高的表现。结论在大鼠同种异体原位肝移植免疫耐受过程中,CD8^+CD45RC^low调节性T细胞显著升高,并在外周血和肝脏中高表达,通过提高抑制性的细胞因子IL-10对长期免疫耐受起重要调节作用。

骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化

目的研究骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化情况及对大鼠长期存活的影响。方法雌性受体大鼠随机分3组:空白对照组(A组)、D-hanks液组(B组)、骨髓干细胞组(C组)。观察大鼠的中位生存时间、肝组织病理变化,基因Sry原位杂交和甲胎蛋白免疫组化双检测观察骨髓干细胞的分化情况。结果C组中位生存时间大于180d(P<0.05);C组无明显的急性排斥反应。基因Sry原位杂交阳性,并且表达甲胎蛋白。结论骨髓干细胞门静脉输注能减轻急性排斥反应,诱导大鼠肝移植术后长期存活;并能在移植肝的环境中诱导分化为肝细胞,表达甲胎蛋白,并逐渐替代移植肝本身的细胞。

减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化

背景:活体肝移植后肝脏再生是影响肝移植预后的关键因素,目前尚未见调控活体肝移植术后肝脏再生的特异性微小RNA(miRNA)的报道。目的:分析miRNAs在大鼠减体积肝移植后各时间点表达谱的变化,挑选并验证目的 miRNAs,为大鼠减体积肝移植后肝脏再生干预策略提供靶标miRNAs,为临床活体肝移植后肝脏再生研究提供理论依据。方法:分别建立大鼠减体积肝移植模型和假手术模型,利用miRNAs基因芯片技术检测miRNAs表达谱的差异。在差异表达的miRNAs中挑选出目的 miRNAs进行实时定量PCR检测,验证芯片结果的可信性。结果与结论:与假手术组大鼠肝组织相比,大鼠减体积肝移植肝脏组织中表达上调的miRNAs有11个,分别为let-7b-5p,let-7c-5p,miR-101a-3p,miR-103-3p,miR-130a-3p,miR-142-5p,miR-186-5p,miR-199a-3p,miR-21-5p,221-3p,miR-34a-5p;表达下调的miRNAs有4个miR-26b-5p,miR-150-5p,miR-19a-3p,rno-miR-146-5p。将挑选出的目的 miRNAs进行PCR验证发现,miR-221-3p,miR-199a-3p在24 h,48 h,1周表达量与所对应的芯片结果近似,各自变化趋势与芯片结果一致,说明miRNA芯片结果可信。结果证实,大鼠减体积肝移植后伴有miRNAs表达谱的变化,实验挑选并验证了目的 miRNAs。

大鼠减体积肝移植腹腔出血的原因分析

目的探讨大鼠减体积肝移植腹腔出血的原因。方法实验大鼠均为健康的SD大鼠,体质量260～280g,供体为雌性,受体为雄性,供、受体体质量相差10g左右,一般为供体体质量比受体体质量轻;供体采用单人裸眼操作,在取肝的过程中即进行减体积操作;受体采用双人裸眼配合操作建立大鼠减体积的稳定模型。结果成功实施的270对大鼠减体积肝移植模型中,因腹腔出血而死亡44例,死亡率为16.3﹪;出血部位的总体分布为肝上下腔静脉吻合口出血28例次,肝脏包膜渗血9例次,肝左外侧叶减体积结扎点出血9例次,肝乳头叶结扎点出血7例次,肝三角叶结扎点出血7例次,右肾上腺和腰静脉出血5例次,肝脏人为损伤出血4例次,门静脉套管口出血4例次,肝下下腔静脉套管口出血4例次,其中肝上下腔静脉吻合口合并肝左外侧叶减体积结扎点出血的有8例,两个减体积结扎点均出血的5例;10例经过缝扎或单纯结扎后止血,肝脏包膜渗血采用热盐水冲洗、浸泡后自行止血6例。结论减体积肝移植术后腹腔出血最常见的是肝上下腔静脉吻合口出血,通过对大鼠减体积肝移植术后腹腔出血的原因分析,其结果可以指导我们实验手术操作的进一步改进,从而提高大鼠肝移植模型的实验手术成功率。

研究针刺肝俞对大鼠原位肝移植急性排斥反应的影响

目的:探讨针刺肝俞对大鼠原位肝移植急性排斥反应的影响。方法:建立肝移植急性排斥模型,80只模型大鼠按随机数字表法分为对照组(生理盐水组)、治疗A组(针刺肝俞组)、治疗B组(他克莫司组)、治疗C组(针刺肝俞+他克莫司组),每组20只。治疗A组针刺肝俞穴,1次/d,每次20 min;治疗B组给予他克莫司0.05 mg/(kg·d)灌胃,1次/d;治疗C组给予他克莫司和针刺肝俞。观察各组大鼠生存率及生存时间,术后第7天取腔静脉血检测肝功能各项指标[总胆红素(TBi L)、结合胆红素(DBi L)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)及谷氨酰转肽酶(GGT)]。结果:与对照组相比,治疗各组的大鼠术后存活时间明显延长,肝功能各项指标均明显下降(P<0.05);与治疗A组比较,治疗B和治疗C组的大鼠术后存活时间明显延长,其肝功能指标也均显著下降(P<0.05);与治疗B组比较,治疗C组的大鼠术后存活时间明显延长,其肝功能各项指标明显下降(P<0.05)。结论:针刺肝俞能有效地减轻大鼠肝移植急性排斥反应,提高大鼠术后生存时间,其可应用于临床抗肝移植急性排斥反应治疗。

乌司他丁干预减体积肝移植模型大鼠的肝脏代谢

背景:乌司他丁在肝切除、肝移植后抗炎、脏器保护、改善微循环等方面的作用已经有大量的研究,然而其作用的microRNA调控机制尚未见报道。目的:观察模型大鼠减体积肝移植后乌司他丁干预microRNA及蛋白组学的变化,并在差异表达的microRNAs和蛋白中预测microRNA对其靶向蛋白的调控,为乌司他丁的临床应用提供更深入的理论依据。方法:以Kamada的双袖套法为基础建立40%减体积肝移植模型大鼠,实验分2组:实验组在肝移植后0,12,24,36,48 h经腹腔注入乌司他丁(100 U/g);对照组在同样时间点注入生理盐水2 mL。在移植后24,48 h取2组大鼠肝脏分别行microRNA芯片检查及蛋白质质谱分析。将二者的结果输入mirTarBase软件进行靶基因预测。结果与结论:①与对照组相比,实验组表达差异超过2倍的mi RNAs有19个,蛋白丰度表达差异超过1.5倍的蛋白有17个,靶基因预测发现一组具有强力证据推荐的microRNA目标蛋白的调控通道:rno-mi R-181a-5p和Gpx1;②结果表明,模型大鼠减体积肝移植后,乌司他丁的使用,改变了rno-mi R-181a-5p的表达,rno-mi R-181a-5p通过调控Gpx1表达来改善模型大鼠减体积肝移植术后肝脏的代谢,这可能是乌司他丁作用机制之一。

大鼠原位肝移植模型不同术式改进的研究

目的 比较两种改进后大鼠原位肝移植模型建立的优缺点。方法 对三套袖法的修肝技术及套管制作进行改进，实施大鼠原位肝移植30例，采用改进的缝合法实施大鼠原位肝移植70例。结果 三袖套法手术成功率80％，1周存活率8％，缝合法手术成功率90％，1周存活率72％。结论 改进后的三袖套法虽然明显缩短手术时间及无肝期，但手术后并发症多，缺乏实际应用价值，改进后的缝合法是建立稳定大鼠肝移植模型的有效方法。

树突状细胞在原位肝移植术后受体脾脏微嵌合体形成中的作用

目的探讨树突状细胞(DCs)在原位肝移植术后受体脾脏微嵌合体形成中的作用。方法以雄性Wistar大鼠为供体,雌性SD大鼠为受体,建立异性别原位肝移植大鼠模型(n=4)。术后第7天处死受体大鼠,分离受体脾脏单个核细胞,建立脾脏来源DCs培养体系,经形态学观察和流式细胞仪检测DCs表面抗原OX62表达予以鉴定。采用PCR技术检测脾脏DCs培养体系的Y染色体基因片段(SRY基因)表达情况,明确受体脾脏中微嵌合体的形成。结果大鼠异性别原位肝移植术后7 d,脾脏来源DCs培养体系的细胞具有DCs的形态学特征,并表达其表型OX62。PCR结果显示,受体脾脏来源DCs培养体系表达供体来源的SRY基因片段。结论原位肝移植后,供体肝源性DCs或其前体在受体内迁移至脾脏,参与了受体微嵌合体的形成。