葛根素对背根神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用机制研究

目的探究葛根素对背根神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用机制。方法将120只大鼠随机平均分为三组,A组大鼠采用背根神经结扎手术,B组大鼠采用鞘内注射葛根素联合背根神经结扎手术,C组大鼠不结扎背根神经,其他手术过程同A组。检测大鼠术后1、3、5和7 d的机械缩足反应阈值和热缩足潜伏期;显微镜下观察背根神经元细胞数量与形态,用western blotting和酶联免疫吸附法检测大鼠背根神经炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)表达。结果术后1、3、5和7d,A组、B组大鼠机械缩足反应阈值与C组相比持续下降(P<0.05);术后3、5和7 d,B组大鼠机械缩足反应阈值均高于A组(P<0.05);术后5 d和7 d,A组、B组大鼠热缩足潜伏期均低于C组(P<0.05);术后7d,B组大鼠的背根神经元细胞数量较多,背根神经节IL-6、IL-1β蛋白表达、染色情况评分高于A组、C组(P<0.05)。结论鞘内注射葛根素可有效减轻神经损伤引起的机械热痛觉过敏和痛觉超敏,并可能通过降低背根神经内的IL-6和IL-1β表达改善神经病理性疼痛。

大鼠慢性背根节压迫诱致DRG大神经元兴奋性增强和Ih电流显著上调

目的:探讨大鼠CCD模型模拟的腰背痛诱致的DRG大神经元兴奋性改变及其离子通道机制。方法:建立大鼠慢性压迫腰膨大L4/L5 DRG的CCD模型,模拟临床常见的腰背痛的触诱发痛表现。制备整节L4/L5 DRG标本,应用全细胞膜片钳技术记录去极化电流刺激诱致的DRG大型神经元的兴奋性改变及其离子通道机制。结果:对直径>50μm的健康的DRG大神经元进行全细胞膜片钳记录。结果显示:给予去极化方波电流刺激可以诱致CCD模型大鼠DRG大神经元呈现兴奋性增强的表现,具体表现为相同刺激强度的电流注射在CCD模型DRG大神经元上诱致的动作电位的频率显著高于对照组神经元。同样的细胞放电增强也见于给予细胞斜波电流刺激。进一步的机制研究分析显示CCD模型大鼠上DRG大神经元的I_h电流明显高于对照组大鼠。结论:CCD模型可以诱致DRG大神经元呈现超兴奋状态,该兴奋性增强的状态主要由I_h电流增强来介导,为认识神经损伤诱致的病理性痛觉敏化尤其是触诱发痛的神经机制提供了实验证据。

坐骨神经损伤大鼠背根神经节基因表达与机械痛阈的相关性

目的:基于生物信息学方法观察大鼠坐骨神经损伤(SNI)模型构建后1、4、7及14 d背根神经节(DRG)中核心差异分子的表达改变并分析与机械性痛阈的相关性。方法:下载GEO数据库中已构建的SNI模型大鼠的DRG基因数据集(GSE30165),应用生物信息学方法筛选DRG中的差异表达基因,将SNI不同时间点的差异基因进行共交集处理后通过STRING数据库分析蛋白质互作(PPI)网络的中心节点蛋白。使用Cytoscape软件对中心节点分子进行最大集团中心度(MCC)、边缘渗出组件(EPC)、度数(degree)、发散性(radiality)及紧密度(closeness)等拓扑分析法评分,并共交集出关键节点分子,分析每个关键节点分子不同时间点的表达量与机械性痛阈的相关性。结果:数据质控和标准化后,PCA结果显示组间区分较好,火山图结果显示,与对照组相比,SNI后1、4、7及14 d分别有2166、2590、3557及6369个差异基因被筛选,其中上调基因分别为1493、1524、1962及3277个,下调基因分别为673、1066、1595及3092个。SNI后1、4、7及14 d的上调和下调基因进行共交集处理,获取SNI后不同时间点的共同上调基因188个,共同下调基因98个。GO富集结果显示上调基因主要参与炎症反应、细胞凋亡及细胞分化过程,富集于胞浆及细胞间隙,介导蛋白质同源二聚体的活化、细胞因子以及激素活力。KEGG富集结果显示上调基因主要涉及MAPK信号通路、神经活性配体-受体的相互作用以及细胞因子-细胞因子受体相互作用等。MCC、EPC、Degree、Radiality及Closeness算法评分结果显示,白细胞介素-6(IL-6)、转录激活因子3(ATF3)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、Janus激酶2(JAK2)及胱天蛋白酶3(CASP3)共6个基因为所获得的核心差异基因。行为学结果显示,与对照组相比,SNI后1 d(P<0.01)、4 d(P<0.001)、7 d(P<0.001)及14 d(P<0.001)大鼠的机械性疼痛阈值显著降低,差异具有统计学意义。相关性分析结果显示ATF3(P=0.021)、FGF2(P=0.005)、MMP3(P=0.002)、JAK2(P=0.013)及CASP3(P=0.006)的mRNA水平与机械性疼痛阈值存在显著相关性,未见IL-6与机械性疼痛阈值存在显著相关性(P=0.133)。结论:ATF3、FGF2、MMP3、JAK2及CASP3在SNI诱发的神经病理性疼痛的早期和慢性期阶段均发挥着关键的作用,并且可能与影响细胞因子及经典MAPK信号通路密切相关,深入的分子机制探索仍需进一步的实验验证。

大鼠脊神经后根切断后脊髓和背根神经节CGRP的表达变化

为观察大鼠脊神经后根切断后相应背根神经节(DRG)和脊髓节段CGRP的表达变化,本研究采用25只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、假手术对照组和L4、5后根切断后3d、7d和14d组(n=5),用免疫组织化学方法结合图像分析技术检测各组相应DRG和脊髓节段内CGRP的表达变化。结果如下:后根切断后3d、7d和14d伤侧DRG内CGRP表达较对照组和对侧明显增强;后根切断后3d脊髓后角CGRP免疫阳性纤维减少,7d、14d时进一步减少;后根切断后3d脊髓前角运动神经元内CGRP表达增加,免疫阳性细胞数增多,7d和14d时表达进一步增强。以上结果提示,脊神经后根切断后DRG和脊髓CGRP表达变化呈现一定的时空模式,可能参与了神经损伤后的再生过程。

5-HT2-7受体亚型mRNAs在坐骨神经分支选择性损伤模型大鼠背根神经节的表达变化

本研究利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,观察了坐骨神经分支选择性损伤(SNI)所致神经病理性痛条件下,大鼠背根神经节(DRG)中5-HT2～7受体亚型mRNAs的时程表达变化.用RT-PCR方法在正常大鼠DRG中检测到5-HT2A、5-HT3、5-HT4、5-HT5A和5-HT7受体亚型mRNAs的表达,但未检测到5-HT2B、5-HT2c、5-HT5B和5-HT6受体亚型mRNAs.SNI能诱导5-HT2A、5-HT3、5-HT4和5-HT7受体亚型mRNAs在损伤侧DRG的表达上调.其中,5-HT2A受体亚型mRNA的表达在术后3 d时开始升高,持续增加至28 d;5-HT3受体亚型mRNA的表达在术后4 d时明显增加,14 d时达到高峰;5-HT4受体亚型mRNA于术后3 d的表达明显增加,21 d时达到高峰;5-HT7受体亚型mRNA的表达在术后1 d时即显著升高,一直维持高水平的表达至28 d.未检测到5-HT5A受体亚型mRNA的表达变化.在SNI对侧的DRG,各受体亚型mRNAs的表达未出现明显变化.部分5-HT受体亚型在SNI模型DRG的表达具有不同的时程变化特点,提示它们在SNI所致的神经病理性痛中发挥着不同的作用.

外源性NGF对大鼠坐骨神经切断缝合术后脊髓和背根节CGRP表达的影响

观察外源性神经生长因子(NGF)对坐骨神经切断立即缝合后大鼠脊髓和背根节(DRG)内不同时间点降钙素基因相关肽(CGRP)表达的影响。成年SD雄性大鼠随机分为NGF组、生理盐水(NS)组、假手术组与正常对照组。实验组动物右侧坐骨神经切断后立即缝合,每天给予NGF(400单位/kg腹腔注射),动物分别存活1、3、5、7、14、21、28d,免疫组织化学方法结合图像分析检测相应节段脊髓和背根节内CGRP的表达。结果表明,NGF处理组术侧背根节与脊髓后角内的CGRP表达明显高于同时间点的NS对照组,平均光密度值相比P<0.05。但各组中脊髓前角运动神经元内的CGRP表达没有明显变化(P>0.05)。结果提示外源性的NGF能明显增加损伤后背根节感觉神经元与损伤侧脊髓后角的CGRP表达,对CGRP在脊髓前角运动神经元内的表达没有明显影响。

葛根素对大鼠背根神经节神经病理性疼痛的镇痛作用

目的探讨葛根素对大鼠背根神经节(DRG)神经病理性疼痛的镇痛作用。方法选取24只雄性SD大鼠,随机分为3组(n=8):手术组(SNL组,仅行脊神经结扎手术)、葛根素治疗组[Pue组,行脊神经结扎手术并鞘内注射葛根素(10μg/m L)]、假手术组(Sham组,不结扎脊神经,其他手术步骤同SNL组)。分别在术前和术后1、3、5、7 d检测各组大鼠的热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足反应阈值(MWT),Western blotting和酶联免疫吸附法(ELISA)检测连续用药7 d后大鼠DRG炎性细胞因子的表达。结果与Sham组比较,SNL组、Pue组术后1、3、5、7 d MWT下降(均P<0.05);Pue组术后5、7 d MWT和TWL均高于SNL组(P<0.05)。与Sham组比较,SNL组DRG中炎性细胞因子IL-1β、IL-6表达均明显升高(P<0.05)。而Pue组DRG中IL-1β、IL-6表达较SNL组均明显下降(均P<0.05)。结论鞘内注射葛根素可缓解大鼠脊神经结扎所致的神经痛,下调DRG中炎性细胞因子IL-1β、IL-6表达,对神经病理性疼痛具有镇痛作用。

5-HT受体亚型mRNAs在大鼠三叉神经节和脊髓背根节的表达——PCR法研究

根据 5- HT受体 13种亚型互补 DNA序列合成相应的特异性引物 ,用 PCR方法对各种 5- HT受体亚型在大鼠三叉神经节及脊髓背根节的表达进行了观察。结果显示 :三叉神经节表达 5- HT1A、5- HT1B、5- HT1D、5- HT2 A、5- HT3、5- HT4 和 5- HT7亚型。背根节表达的 5- HT受体亚型与三叉神经节者相同 ,但这些亚型的电泳条带密度在两种神经节存在着差异。三叉节的 5- HT1D和 5- HT3电泳条带密度最高 ,5- HT1A和 5- HT4 次之 ,5- HT1B、5- HT2 A和 5- HT7较弱 ;背根节的 5- HT3和 5- HT1D电泳条带密度最强 ,5- HT1B和 5- HT2 A次之 ,而 5-HT1A、5- HT4 和 5- HT7则较弱。将各亚型的 PCR阳性产物进一步克隆至 p CR 载体进行序列测定 ,结果表明这些 PCR产物的 DNA序列与已知的各亚型的序列一致。本研究的结果对进一步探讨 5-

大鼠蛛网膜下腔置管及背根神经节分离方法的改进

目的探讨改进大鼠蛛网膜下腔置管术与分离背根神经节的方法。方法成年SD大鼠20只,麻醉后行背部L3～4间隙皮肤纵切口,钝性分离棘突周围肌肉,部分L3～4棘突切除。7号针头探查并穿破硬脊膜,以鼠尾突然出现侧摆及后腿抽动为成功标志。向尾侧置入PE-10导管2cm。固定导管,埋于皮下。术后每天观察大鼠有无脊髓神经损伤表现。术后第2天鞘内注射2%罗哌卡因40μl,观察双下肢阻滞效果。术后第7天,鞘内注射20μl亚甲蓝标记导管尖端位置,4%多聚甲醛灌注固定后打开椎管及椎间孔,观察导管位置,辨认并分离背根神经节,显微镜下确认组织结构。结果术后每天观察置管后的大鼠,未见明显脊髓神经损伤症状,20只均未出现神经并发症。术后第2天,鞘内注射2%罗哌卡因,大鼠全部出现双下肢麻痹。术后第7天,解剖大鼠椎管证实置管位置正确。显微镜下观察确认所取组织为背根神经节。结论改进后的大鼠蛛网膜下腔置管术损伤小,成功率高。背根神经节分离方法简单、组织破坏小。

吗啡耐受大鼠背根神经节磷酸化p38 MAPK的表达

【目的】观察蛛网膜下腔(鞘内)慢性注射吗啡是否激活背根神经节(DRG)神经元,使其p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平发生改变。【方法】通过对成年雄性SD大鼠连续7 d鞘内注射吗啡15μg而建立吗啡耐受的动物模型,或连续7 d在吗啡注射前30 min预先鞘内注射p38 MAPK抑制剂SB203580 10μg,用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果,并用免疫组织化学法观察DRG磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表达变化。【结果】慢性鞘内注射吗啡7 d后,吗啡镇痛作用明显下降(P<0.001),吗啡耐受形成;而SB203580预处理可明显抑制吗啡耐受的形成(P<0.001);免疫组织化学染色显示脊髓DRG p-p38 MAPK表达明显上调(P<0.01),且以小、中型神经元增加为主。【结论】鞘内慢性注射吗啡可激活脊髓DRG小型和中型神经元,使其p38 MAPK磷酸化水平增加,这可能是吗啡耐受的机制之一。

大鼠背根神经节细胞中TRPV1与cAMP/PKA通路调控机制研究

目的探讨大鼠背根神经节细胞中,辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)与体内cAMP/PKA信号通路的调控作用。方法分离培养大鼠背根神经节原代细胞,分别应用cAMP/PKA信号通路的激动剂8-Br-cAMP和抑制剂H-89,TRPV1的激动剂辣椒素(capsaicin)、抑制剂i RTX进行干预,应用定量PCR和Western blot检测各组细胞的TRPV1、p-PKA的基因和蛋白表达,探讨TRPV1与体内cAMP/PKA信号通路之间的调控机制。结果与空白对照组比较,8-Br-cAMP组、capsaicin组TRPV1的基因及蛋白表达均明显增强,iRTX组TRPV1的基因及蛋白表达明显降低,H-89组TRPV1基因、蛋白的表达无明显变化;8-Br-cAMP组p-PKA的基因及蛋白表达明显增强,H-89组p-PKA的基因及蛋白表达明显降低,而capsaicin组、iRTX组p-PKA基因、蛋白的表达无明显变化。结论 cAMP-PKA信号通路是调控TRPV1表达的重要作用机制之一,同时可能存在其他信号通路对TRPV1也有一定调控作用。

大鼠坐骨神经切断后Robo2在脊髓及背根节的表达变化

目的:研究坐骨神经损伤后Roundabout 2(Robo2)在成年大鼠背根节和脊髓的表达变化。方法:健康成年雌性SD大鼠坐骨神经切断后分别存活3～28d,取其L_(4～6)背根节(DRG)和脊髓;利用RT-PCR和免疫组织化学技术检测Robo2在上述组织中的表达变化。图像分析技术对阳性细胞的灰度值进行测定。结果:正常DRG感觉神经元表达Robo2 mRNA和蛋白质,脊髓前角运动神经元不表达。坐骨神经切断后3 d DRG内Robo2表达增加,7～14 d达高峰,21～28 d恢复到正常水平。结论:坐骨神经切断可导致DRG内Robo2的表达上调,可能与早期的感觉轴突再生有关。

5-HT_(1A)受体亚型mRNA在坐骨神经分支选择性损伤模型大鼠脊髓和背根节中的表达变化(英文)

坐骨神经分支选择性损伤 (SNI)模型是一种新型神经病理痛模型。本实验用 SD雄性大鼠 ,分支结扎并切断左侧坐骨神经干的胫神经和腓总神经 ,保留腓肠神经分支 ,右侧仅暴露坐骨神经。术后 1、2、3、4、7、14、2 1和 2 8d,用 RT-PCR的方法对 5 -HT1 A受体 m RNA在腰髓的背角和背根神经节 (DRG)的表达水平进行检测。结果显示 ,5 -HT1 A受体 m RNA在损伤侧腰髓背角内的表达水平于 1d后开始升高 ,7d时达高峰 ,随后逐渐下降 ,但仍高于正常水平。其表达水平在对侧脊髓背角内没有明显变化。在损伤侧 DRG内 ,5 -HT1 A受体 m RNA的表达水平于 1d后开始增高 ,4d时达高峰 ,随后开始下降 ,但仍维持较高的表达水平 ;而损伤对侧 DRG内的 5 -HT1 A受体 m RNA的表达没有变化。上述结果提示 5 -HT1 A受体亚型可能在脊髓及外周伤害性信息的传递和调节中发挥着重要作用 ,本研究的结果为进一步了解 5 -HT1 A受体在神经病理性痛中的作用机制提供了依据。

大鼠腰神经根受压后背根神经节和脊髓后角含生长抑素mRNA阳性神经元的变化

目的 :探讨大鼠腰神经根受压后背根神经节和脊髓后角含生长抑素 m RNA阳性神经元的变化。方法 :选用12只 Wistar大鼠 ,随机分为实验组和正常组 ,实验组用硅胶管压迫右 L4脊神经后根 ,采用原位杂交法结合图像分析进行研究。结果 :大鼠腰神经根受压 4周后 ,实验组背根神经节和脊髓后角内生长抑素 m RNA阳性神经元神经元的数量和平均面积明显增多 ,与正常组相比均有显著性差异。神经元以中、小型神经元为主。结论 :大鼠腰神经根受压后可使背根神经节和脊髓后角内神经元生长抑素 m RNA的表达上调 。

针刺对鼠部分背根切断模型的背根神经节和脊髓背角内生长相关蛋白GAP43表达的影响

制备大鼠备用根模型 （切断单侧腰骶背根Ｌ２， ３， ４， ６， 及Ｓ１， ２， 保留Ｌ５ 背根）， 用免疫组织化学和原位杂交方法研究生长相关蛋白ＧＡＰ４３ 在相应节段背根神经节和脊髓背角表达的变化及针刺对其表达的影响。结果发现， 切断一侧Ｌ２， ３， ４， ６， 及Ｓ１， ２ 背根后， 它们对应的背根神经节内ＧＡＰ４３ 表达与正常对照组和假手术组相比无显著性差别， 而备用根神经节Ｌ５ 的ＧＡＰ４３ 表达较正常对照组和假手术组明显增强； 手术侧Ｌ５ 水平脊髓背角与正常对照组相比ＧＡＰ４３ 阳性信号加强。针刺后可促进手术侧Ｌ５ 神经节内ＧＡＰ４３ 表达增加； Ｌ５ 水平脊髓背角ＧＡＰ４３ 阳性信号也进一步加强这表明在一定条件下， 神经系统损伤可诱发中枢神经系统ＧＡＰ４３ 介导的可塑性变化， 针刺可通过ＧＡＰ４３ 对神经的可塑性起调节作用。

神经再生素促大鼠背根神经节生长作用的研究

目的研究神经再生素(NRF)对体外培养新生大鼠背根神经节生长及NF-H表达的影响。方法体外大鼠背根神经节(DRG)培养;免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR和Western blot等方法。结果免疫荧光细胞化学结果提示,NRF能促进背根神经节神经突起的生长,浓度为2.0 mg/L时生长状况最佳;实时荧光定量PCR和Western blot结果提示,NRF能增加体外培养的背根神经节NF-H mRNA和蛋白的表达,在浓度为2.0 mg/L时表达最高。结论NRF能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和NF-H的表达,表明NRF对发育期感觉神经元具有神经营养作用。

电生理学特性得到确定的大鼠脊髓背根神经节细胞内谷氨酸和P物质的共存

在离体灌流带脊髓和坐骨神经的标本上，对脊髓背根神经节（DRG）细胞的电生理学特性、对P物质（SP）受体激动剂的反应及谷氨酸（Glu）／SP共存的特点进行了研究。（1）对135个细胞进行了细胞内记录，并依纤维传导速度将其分为Aα／β（＞12m／s）和C（＜1．3m／s）两大类；它们的动作电位的快速后超极化（fAHP）有明显区别，C类的fAHP幅度小、时程长，Aα／β类的fAHP幅度大、时程短；（2）SP受体激动剂Sar－SP（10－6mol／L）诱导42％（5／12）的Aα／β细胞和80％（8／10）的C细胞发生去极化反应；（3）最后向给予SP受体激动剂的22个细胞内电泳biocytin，固定、切片后进行磷酸激活的谷氨酰胺酶（PAG）和SP免疫荧光组织化学染色并同时显示biocytin，观察到biocytin标记并呈PAG样和SP样阳性的三标细胞在Aα／β类为25％（3／12），C类为80％（8／10），两者差异显著（P＜0.05）。结果提示DRG中Aα／β细胞与C细胞的化学解剖和电生理特性不同，SP可能通过作用于节细胞上的自身受体易化冲动的发放。

胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠背根节分布的免疫组织化学研究

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)在成年大鼠背根节中的分布。 方法 用 GDNF多克隆抗体免疫组织化学 ABC法及图像分析方法。 结果 GDNF免疫反应主要存在于背根节的小神经细胞中 ,背根节的大神经细胞呈弱阳性反应 ,与背根节相连的感觉神经纤维呈免疫反应性。 结论 GDNF在背根节感觉神经元和神经纤维中有一定量的分布。

胶质源性神经营养因子对损伤的培养大鼠背根神经节的作用

目的 应用体外培养海人藻酸 (KA)兴奋性毒素损伤的细胞模型 ,研究 GDNF对损伤的背根节神经元的不同作用 ,为进一步研究 GDNF对神经元作用机制 ,表达产生及检测方法提供思路 .方法 采用原代培养的方法 ,用 N1无血清分离培养背根节神经元 ,再用 5μm ol· L- 1 KA作用 6～ 8h ,加上含有 GDNF的无血清培养基 ,继续培养 2 4h,然后用MTT法检测反映细胞的活性 ,胎盘蓝染色记数、细胞总蛋白测定以及形态学观察突起的生长状况 .结果 1细胞活性 A值 :GDNF+KA(0 .0 32 8± 0 .0 0 6 ) ,KA(0 .0 2 85± 0 .0 0 75 ) ,GDNF (0 .0 398± 0 .0 0 2 ) ,Blank(0 .0 41± 0 .0 0 2 ) (P<0 .0 5 ) ;2活细胞数相应为 GDNF+KA (6 0± 4.4) ,KA(35 .7±2 .2 ) ,GDNF (5 9.3± 3.6 ) ,Blank (5 7.7± 2 .9) ;3细胞的总蛋白分别为 GDNF+KA (70 .3± 9.2 ) (P<0 .0 1) ,KA (49.0± 3.7) ,GDNF (75 .0± 7.3) ,Blank (6 8.0± 5 .5 ) (P<0 .0 1) ;4突起长度 :实验组与对照组不明显 ,GDNF组与空白对照组不明显 .结论 在正常无血清体外培养情况下 GDNF对DRG神经元作用不明显 ,在 KA兴奋性毒素损伤后 ,对细胞的活性、存活及总蛋白合成有明显的保护作用 ,但对突起的生长则没有明显的促进作用 .

背根神经节脉冲射频对大鼠SNI疼痛模型机械性痛阈的影响

应用脉冲射频治疗疼痛的作用机制尚不十分清楚。内啡肽是体内主要的内阿片肽之一,是对疼痛通路进行调节的主要抑制性递质,对疼痛的调节作用突出。本实验选择SNI模型模拟临床神经病理性疼痛,并应用背根神经节脉冲射频,观察其对大鼠下丘脑β-内啡肽以及机械性痛阈的影响，探讨背根神经节脉冲射频镇痛作用的可能机制。