c-Jun氨基末端激酶信号通路对肥胖诱导的大鼠胰岛β细胞凋亡的调控作用

目的探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路对肥胖诱导的大鼠胰岛B细胞凋亡的调控作用。方法采用高脂饲料喂养雄性SD大鼠建立肥胖模型。造模成功后，取对照组和肥胖组大鼠各10只，检测其空腹血糖、游离脂肪酸及血清胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数。观察其胰腺组织病理学变化，并检测其胰腺组织中胰岛素、胰岛细胞凋亡指数及胰腺组织肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、磷酸化JNK（p-JNK）、B细胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达水平。结果肥胖组大鼠胰腺组织出现腺泡结构破坏、脂质块状沉积等病理学改变。肥胖组大鼠空腹血糖、游离脂肪酸、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数、B细胞凋亡指数、TNF-β、IL-1β、胰腺组织中胰岛素、P-JNK、Bax的表达水平显著高于对照组（P均〈0．05）；而Bcl-2表达水平显著低于对照组（P〈0．05）。结论JNK信号通路在肥胖大鼠被激活，进而发挥促肥胖诱导的大鼠胰岛β细胞凋亡的作用。

白藜芦醇减轻大鼠胰岛β细胞瘤细胞低氧损伤

目的研究白藜芦醇减轻大鼠胰岛β细胞瘤细胞(INS-1)低氧损伤的作用。方法将INS-1细胞分为三组,即常氧对照组(control)、低氧组(hypoxia)、低氧及白藜芦醇组(hypoxia+RSV);采用正常培养方法培养常氧对照组,用CCK8检测不同低氧时间(6、12、24、48 h)的细胞增殖情况,选择合适的时间条件构建低氧模型并用于下一步研究;再以不同浓度的白藜芦醇(8、10、12、15μmol/L)提前干预12 h,并进行前期设定的低氧条件处理,用CCK8检测合适的浓度条件,构建白藜芦醇干预模型并用于下一步研究。以组织活性氧试剂盒及线粒体超氧化物试剂盒检测氧化应激水平;线粒体膜电位及ATP水平检测线粒体功能;流式细胞仪分析检测凋亡;胰岛素定量检测试剂盒检测胰岛素分泌量;实时定量反转录检测Sirt1、Pdx1、Glut2的表达水平;蛋白免疫印迹检测相应蛋白水平。结果与常氧对照组相比,低氧组细胞增殖降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.01),线粒体功能降低(P<0.05),胰岛素分泌减少(P<0.05),Sirt1、Pdx1、Glut2基因及其相应蛋白表达水平降低(P<0.05)。而白藜芦醇干预可以明显减轻低氧应激损伤(P<0.05),促进增殖(P<0.05),逆转凋亡(P<0.01),改善线粒体功能(P<0.05),促进胰岛素分泌(P<0.05),促进Sirt1、Pdx1、Glut2基因及其相应蛋白表达水平(P<0.05)。结论白藜芦醇可以保护低氧造成的INS-1细胞氧化应激损伤,改善线粒体功能,抗凋亡,并促进胰岛素功能性基因表达,促进胰岛素分泌。

亚砷酸钠诱导大鼠胰岛β细胞株INS-1凋亡及其机制的研究

目的研究亚砷酸钠（sodiumarsenite）对大鼠胰岛β细胞株INS-1（INS-1细胞）的凋亡作用及其机制。方法将INS-1细胞暴露于不同浓度的亚砷酸钠，首先进行噻唑蓝（MTT）试验，并用荧光分光光度计测定INS-1细胞线粒体膜电位及溶酶体膜电位的吸光度（A）值；并于亚砷酸钠作用后，应用荧光显微镜和流式细胞仪观察并检测INS-1细胞的凋亡情况。结果经亚砷酸钠作用后，INS-1细胞的活性明显下降，且细胞活性随着亚砷酸钠剂量的升高而降低；24h后，细胞线粒体膜电位荧光值明显下降，且随着亚砷酸钠剂量的增加而降低，差异有统计学意义（P〈0．01）；48h后，细胞溶酶体膜电位荧光值明显上升，且随着亚砷酸钠剂量的增加而升高，差异有统计学意义（P〈0．01）；72h后，荧光显微镜下观察细胞，出现凋亡，随着亚砷酸钠剂量的增加，凋亡的细胞也随之增多，镜下呈亮蓝色，胞核固缩、裂解为碎块出现凋亡小体和核碎裂，部分染色质出现浓缩状态；流式细胞仪检测结果，经亚砷酸钠处理后，凋亡的细胞明显增多，且随着亚砷酸钠剂量的增高，凋亡细胞数量也随之增多。结论亚砷酸钠通过线粒体一溶酶体途径诱导大鼠胰岛β细胞株INS-1凋亡。

红车轴草总黄酮通过调控miR-99a-3p/CD36表达对高糖诱导的大鼠胰岛β细胞的保护作用

目的研究红车轴草总黄酮对高糖诱导的大鼠胰岛β细胞损伤的影响,及其潜在的分子机制。方法本实验分为对照组,模型组,低、中、高剂量实验组,miR-NC组,miR-99a-3p组,anti-miR-NC,anti-miR-99a-3p组,模型+miR-NC组,模型+miR-99a-3p组,模型+si-NC组,模型+si-CD36组,高剂量实验+anti-miR-NC组和高剂量实验+anti-miR-99a-3p组。对照组给予5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;模型组给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;低、中、高剂量实验组分别给予12.5,25.0和50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮和25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组分别转染miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p;模型+miR-NC组、模型+miR-99a-3p组、模型+si-NC组、模型+si-CD36组均给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理,并分别转染miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36;高剂量实验+anti-miR-NC组、高剂量实验+anti-miR-99a-3p组均给予50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮+25 mmol·L^(-1)葡萄糖,并分别转染anti-miR-NC或anti-miR-99a-3p。用流式细胞术测定细胞凋亡率,用定量实时聚合酶链反应检测细胞中miR-99a-3p和CD36 mRNA的表达水平。结果模型组INS-1细胞中CD36 mRNA(2.74±0.27 vs 1.01±0.08)和细胞凋亡率[(27.63±2.71)%vs(5.69±0.58)%]均较对照组显著升高,miR-99a-3p(0.38±0.03 vs 1.00±0.09)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量实验组的上述结果相反。模型+miR-99a-3p组的细胞凋亡率[(12.48±1.19)%vs(26.84±2.41)%]较模型+miR-NC组显著降低,miR-99a-3p表达量(0.79±0.07 vs 0.34±0.03)较模型+miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型+si-CD36组INS-1细胞中CD36 mRNA(1.35±0.12 vs 2.81±0.26)及细胞凋亡率[(13.54±1.32)%vs(25.87±2.52)%]均较模型+si-NC组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高剂量实验+anti-miR-99a-3p组INS-1细胞中miR-99a-3p(0.43±0.14 vs 0.88±0.06)较高剂量实验+anti-miR-NC组显著降低,CD36 mRNA(2.51±0.22 vs 1.41±0.13)及细胞凋亡率[(20.45±2.03)%vs(10.56±1.02)%]均较高剂量实验+anti-miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论红车轴草总黄酮可能通过调控miR-99a-3p/CD36以减轻高糖对大鼠胰岛β细胞INS-1的损伤,进而抑制细胞的凋亡。

两种砷化物诱导胰岛细胞的凋亡

背景:近年有流行病学调查显示砷暴露与糖尿病发病相关。目的:实验从砷导致胰岛β细胞凋亡的机制入手,阐明砷化物相关糖尿病的致病机制。方法:将砷酸氢二钠(Na2HAsO 4·7H2O,iAs5+,50,100,200μmol/L)和二甲基胂酸钠(C2H6AsNaO2·3H2O,DMA5+,100,200,400μmol/L)分别作用于大鼠胰岛细胞株(INS-1细胞)24 h或48 h。通过MTT法检测砷化物对胰岛细胞的毒性作用。用Annexin V-FITC/PI和Hoechst 33258染色法检测两种砷化物致细胞凋亡情况。用2’,7’-二氢二氯荧光素染色检测细胞内活性氧的含量,用Western blot检测细胞内P53的蛋白含量变化。结果与结论:砷酸氢二钠(>50μmol/L)、二甲基胂酸钠(>100μmol/L)均降低大鼠胰岛β细胞的细胞存活率(P<0.05,P<0.01);砷酸氢二钠(50-200μmol/L)和二甲基胂酸钠(100-400μmol/L)作用于大鼠胰岛β细胞48 h后,细胞发生凋亡。砷酸氢二钠、二甲基胂酸钠暴露24 h引起大鼠胰岛β细胞内活性氧水平呈剂量依赖性升高(P<0.05,P<0.01)。经砷酸氢二钠染毒的胰岛β细胞的细胞核内P53蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01),而经二甲基胂酸钠染毒的大鼠胰岛β细胞的细胞核内P53蛋白表达差异无显著性意义。结果说明,两种砷化物砷酸氢二钠、二甲基胂酸钠均可引起胰岛β细胞凋亡,可能与砷所致活性氧水平增高有关。

逍遥散含药血清影响RIN-m5f细胞活性及胰岛素分泌的机制探讨

目的研究逍遥散含药血清对应激损伤状态糖尿病细胞模型[大鼠胰岛β细胞瘤细胞(RIN-m5f)]的活性、胰岛素(INS)分泌的影响及其干预机制。方法用高浓度葡萄糖(50mmol·L^-1)和皮质酮(CORT,320μmol·L^-1)诱导培养RIN-m5f细胞12h,制备应激损伤状态糖尿病细胞模型,再用30%逍遥散含药血清干预,并设立空白血清对照。共分为7组:①正常组:RIPM1640+10%FBS;②高糖组(G组):①+50mmol·L^-1的葡萄糖;③应激组(GCo组):②+320μmol·L^-1的CORT;④空白血清高糖组(GC组):②+30%空白组大鼠血清(30%C)⑤逍遥散血清高糖组(GX组):②+30%逍遥散组大鼠血清(30%X);⑥空白血清应激组(GCoC组):③+30%C;⑦逍遥散血清应激组(GCoX组):③+30%X。干预12h后,采用CCK-8法检测细胞活性;酶联免疫法(ELISA)检测细胞INS分泌水平;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞活化转录因子6(ATF-6)、肌醇需酶1(IRE-1)mRNA表达;Western Blot法检测细胞Caspase-12、CHOP蛋白表达。结果与正常组比较,G组细胞活性和ATF6、IRE1 mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01),INS水平显著升高(P<0.01)。与G组比较,GCo组细胞活性显著降低(P<0.01),INS水平和ATF6、IRE1 mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平均明显上调(P<0.05,P<0.01)。与GC组比较,GX组的细胞活性明显升高(P<0.05),ATF6、IRE1mRNA以及Caspase-12蛋白表达水平均明显上调(P<0.05,P<0.01),但INS水平、CHOP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与GCoC组比较,GCoX组的细胞活性、INS水平明显升高(P<0.05),IRE1mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平明显下降(P<0.05,P<0.01),但ATF6mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论高浓度葡萄糖和CORT能降低应激损伤状态糖尿病RINm5f细胞的活性,升高INS水平,加重胰岛素抵抗(IR)程度。逍遥散含药血清能缓解细胞IR水平,其作用机制可能与调控内质网应激(ERS)相关。

亚砷酸钠对胰岛细胞中p53、mdm2和Kras基因及蛋白表达的影响

目的探讨砷对大鼠胰岛β细胞(INS-1)p53、mdm2和Kras基因和蛋白表达的影响。方法荧光实时定量PCR法检测亚砷酸钠对大鼠胰岛β细胞中野生型p53(Tp53)、mdm2和Kras基因表达的影响,Western blot检测亚砷酸钠对大鼠胰岛β细胞突变型p53和mdm2蛋白表达的影响。结果亚砷酸钠作用于INS-1细胞后,Tp53基因水平降低,mdm2、Kras基因水平升高;突变型p53和mdm2蛋白表达增加。结论亚砷酸钠可使INS-1细胞中抑癌基因Tp53向突变型p53转变,癌基因mdm2和Kras的水平升高。