目的探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)及BSD基因筛选抗生素(blasticidin)浓度。方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120(TU number/ce...目的探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)及BSD基因筛选抗生素(blasticidin)浓度。方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120(TU number/cell)分别侵染INS-1空白细胞,培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率(%)及死亡率(%),以确定最佳MOI值。小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg/m L blasticidin,第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率,以确定细胞抗生素敏感浓度。使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒(病毒滴度:1×108TU/m L)按照最佳MOI值侵染细胞,并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选,获得混合系细胞。当细胞的荧光率达90%时,进行单克隆稳转细胞系的构建。结果最佳MOI值为60,此时细胞的荧光率达100%,但细胞的死亡率<0.5%,细胞保持原有的形态。当blasticidin敏感浓度为2μg/m L,此时空白细胞失去原有的贴壁性,全部死亡。INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58,且siRNA的干扰效率为77.78%,siRNA成功表达,混合稳转细胞系构建成功。成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。展开更多
目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-C...目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。展开更多
目的研究红车轴草总黄酮对高糖诱导的大鼠胰岛β细胞损伤的影响,及其潜在的分子机制。方法本实验分为对照组,模型组,低、中、高剂量实验组,miR-NC组,miR-99a-3p组,anti-miR-NC,anti-miR-99a-3p组,模型+miR-NC组,模型+miR-99a-3p组,模型+...目的研究红车轴草总黄酮对高糖诱导的大鼠胰岛β细胞损伤的影响,及其潜在的分子机制。方法本实验分为对照组,模型组,低、中、高剂量实验组,miR-NC组,miR-99a-3p组,anti-miR-NC,anti-miR-99a-3p组,模型+miR-NC组,模型+miR-99a-3p组,模型+si-NC组,模型+si-CD36组,高剂量实验+anti-miR-NC组和高剂量实验+anti-miR-99a-3p组。对照组给予5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;模型组给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;低、中、高剂量实验组分别给予12.5,25.0和50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮和25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组分别转染miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p;模型+miR-NC组、模型+miR-99a-3p组、模型+si-NC组、模型+si-CD36组均给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理,并分别转染miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36;高剂量实验+anti-miR-NC组、高剂量实验+anti-miR-99a-3p组均给予50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮+25 mmol·L^(-1)葡萄糖,并分别转染anti-miR-NC或anti-miR-99a-3p。用流式细胞术测定细胞凋亡率,用定量实时聚合酶链反应检测细胞中miR-99a-3p和CD36 mRNA的表达水平。结果模型组INS-1细胞中CD36 mRNA(2.74±0.27 vs 1.01±0.08)和细胞凋亡率[(27.63±2.71)%vs(5.69±0.58)%]均较对照组显著升高,miR-99a-3p(0.38±0.03 vs 1.00±0.09)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量实验组的上述结果相反。模型+miR-99a-3p组的细胞凋亡率[(12.48±1.19)%vs(26.84±2.41)%]较模型+miR-NC组显著降低,miR-99a-3p表达量(0.79±0.07 vs 0.34±0.03)较模型+miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型+si-CD36组INS-1细胞中CD36 mRNA(1.35±0.12 vs 2.81±0.26)及细胞凋亡率[(13.54±1.32)%vs(25.87±2.52)%]均较模型+si-NC组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高剂量实验+anti-miR-99a-3p组INS-1细胞中miR-99a-3p(0.43±0.14 vs 0.88±0.06)较高剂量实验+anti-miR-NC组显著降低,CD36 mRNA(2.51±0.22 vs 1.41±0.13)及细胞凋亡率[(20.45±2.03)%vs(10.56±1.02)%]均较高剂量实验+anti-miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论红车轴草总黄酮可能通过调控miR-99a-3p/CD36以减轻高糖对大鼠胰岛β细胞INS-1的损伤,进而抑制细胞的凋亡。展开更多
文摘目的探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)及BSD基因筛选抗生素(blasticidin)浓度。方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120(TU number/cell)分别侵染INS-1空白细胞,培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率(%)及死亡率(%),以确定最佳MOI值。小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg/m L blasticidin,第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率,以确定细胞抗生素敏感浓度。使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒(病毒滴度:1×108TU/m L)按照最佳MOI值侵染细胞,并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选,获得混合系细胞。当细胞的荧光率达90%时,进行单克隆稳转细胞系的构建。结果最佳MOI值为60,此时细胞的荧光率达100%,但细胞的死亡率<0.5%,细胞保持原有的形态。当blasticidin敏感浓度为2μg/m L,此时空白细胞失去原有的贴壁性,全部死亡。INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58,且siRNA的干扰效率为77.78%,siRNA成功表达,混合稳转细胞系构建成功。成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。
文摘目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。
文摘目的研究红车轴草总黄酮对高糖诱导的大鼠胰岛β细胞损伤的影响,及其潜在的分子机制。方法本实验分为对照组,模型组,低、中、高剂量实验组,miR-NC组,miR-99a-3p组,anti-miR-NC,anti-miR-99a-3p组,模型+miR-NC组,模型+miR-99a-3p组,模型+si-NC组,模型+si-CD36组,高剂量实验+anti-miR-NC组和高剂量实验+anti-miR-99a-3p组。对照组给予5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;模型组给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;低、中、高剂量实验组分别给予12.5,25.0和50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮和25 mmol·L^(-1)葡萄糖处置;miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组分别转染miR-NC、miR-99a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-99a-3p;模型+miR-NC组、模型+miR-99a-3p组、模型+si-NC组、模型+si-CD36组均给予25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理,并分别转染miR-NC、miR-99a-3p、si-NC、si-CD36;高剂量实验+anti-miR-NC组、高剂量实验+anti-miR-99a-3p组均给予50.0 mg·L^(-1)红车轴草总黄酮+25 mmol·L^(-1)葡萄糖,并分别转染anti-miR-NC或anti-miR-99a-3p。用流式细胞术测定细胞凋亡率,用定量实时聚合酶链反应检测细胞中miR-99a-3p和CD36 mRNA的表达水平。结果模型组INS-1细胞中CD36 mRNA(2.74±0.27 vs 1.01±0.08)和细胞凋亡率[(27.63±2.71)%vs(5.69±0.58)%]均较对照组显著升高,miR-99a-3p(0.38±0.03 vs 1.00±0.09)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量实验组的上述结果相反。模型+miR-99a-3p组的细胞凋亡率[(12.48±1.19)%vs(26.84±2.41)%]较模型+miR-NC组显著降低,miR-99a-3p表达量(0.79±0.07 vs 0.34±0.03)较模型+miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型+si-CD36组INS-1细胞中CD36 mRNA(1.35±0.12 vs 2.81±0.26)及细胞凋亡率[(13.54±1.32)%vs(25.87±2.52)%]均较模型+si-NC组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高剂量实验+anti-miR-99a-3p组INS-1细胞中miR-99a-3p(0.43±0.14 vs 0.88±0.06)较高剂量实验+anti-miR-NC组显著降低,CD36 mRNA(2.51±0.22 vs 1.41±0.13)及细胞凋亡率[(20.45±2.03)%vs(10.56±1.02)%]均较高剂量实验+anti-miR-NC组显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论红车轴草总黄酮可能通过调控miR-99a-3p/CD36以减轻高糖对大鼠胰岛β细胞INS-1的损伤,进而抑制细胞的凋亡。
