胰淀素对高糖刺激下大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1ATP敏感性钾通道的影响

目的观察胰淀素短时间作用对高糖刺激的大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的ATP敏感性钾通道fK。通道）的影响。方法以Ins-1细胞为研究对象，随机分为16．7mmol／L葡萄糖处理组及0．1、1、10μmol／L胰淀素预处理组，采用全细胞膜片钳技术分析不同浓度胰淀素短时间作用对高糖刺激下Ins-1细胞KKIP通道电生理学特性的影响，同时收集细胞培养上清液应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定孵育液中的胰岛素含量。组间数据比较采用t检验。结果与16．7mmol／L葡萄糖组相比，0．1μmol／L胰淀素预处理组胰岛索释放量及KNTP通道半数激活电压（V0.5，）差异均无统计学意义[分别为（5．57±0．93）比（4．95±0．49）μg／L和（9．4±1．4）比（13．0±2．4）mV，t=1．022、-2．244，均P〉0、05]；而1μmol／L及10μmol／L胰淀素预处理组胰岛素释放量分别显著下降为（3．44＋0．32）和（2．23±0．55）gg／L（t=3．751、5．354，均P〈0．05），而V。则分别显著提高到（28．2±2．7）和（33．3±2．1）mV（t=-5．053、-10．707，均P〈0．05）。结论高浓度咦淀素短时间作用可通过抑制高糖对K。，通道的关闭作用进而抑制Ins．1细胞胰岛素分泌。

间歇性高糖对大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的损伤作用及对第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶表达的影响

目的探讨间歇性高糖对大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的损伤作用及对第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶（PTEN）表达的影响。方法将Ins．1细胞分为正常组（CG组，11．1mmol／L葡萄糖培养）、持续高糖组（SHG组，33．3mmol／L葡萄糖培养）、间歇性高糖组（IHG组，11．1mmol／L及33-3mmol／L葡萄糖交替培养12h），3组细胞均培养3d。欧文比色法（MTS）~定细胞增殖活性，膜联蛋白v-异硫氰酸荧光素／碘化丙啶（AnnexinV／PI）双染细胞后，以流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率，放免法测各组细胞胰岛素分泌，2’，7’．二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH—DA）荧光探针测定各组细胞内活性氧簇（ROS）水平，倒置相差显微镜下观察各组细胞形态，钙离子荧光探针法（Fluo3-AM）测定细胞内钙离子浓度，Westernblotting法测定各组细胞PTEN蛋白表达。各组内均数比较采用单因素方差分析。结果SHG组细胞凋亡率、细胞内ROS水平、细胞内钙离子浓度及PTEN表达均较CG组显著增加（t=8．310、10．261、17．890、5．123，均P〈0．05），细胞增殖活性、胰岛素分泌均较CG组显著降低（t=-19．630、-2．053，均P〈0．05）。IHG组细胞凋亡率、细胞内ROS水平以及钙离子浓度及PTEN表达均较CG组及SHG显著增加（t=6．200～18．227，均P〈0．05），细胞增殖活性、胰岛素分泌均较CG组及SHG组均显著降低（t=-27．800、-2．790、-8．167、-1．503，均P〈0．05）。IHG组较SHG组及CG组Ins-1细胞异型性明显、细胞数量显著减少且排列紊乱。结论氧化应激参与高糖对Ins．1细胞的损伤作用，可能与PTEN表达增高有关，间歇性高糖对INS．1细胞的损伤作用较持续性高糖严重。

白藜芦醇减轻大鼠胰岛β细胞瘤细胞低氧损伤

目的研究白藜芦醇减轻大鼠胰岛β细胞瘤细胞(INS-1)低氧损伤的作用。方法将INS-1细胞分为三组,即常氧对照组(control)、低氧组(hypoxia)、低氧及白藜芦醇组(hypoxia+RSV);采用正常培养方法培养常氧对照组,用CCK8检测不同低氧时间(6、12、24、48 h)的细胞增殖情况,选择合适的时间条件构建低氧模型并用于下一步研究;再以不同浓度的白藜芦醇(8、10、12、15μmol/L)提前干预12 h,并进行前期设定的低氧条件处理,用CCK8检测合适的浓度条件,构建白藜芦醇干预模型并用于下一步研究。以组织活性氧试剂盒及线粒体超氧化物试剂盒检测氧化应激水平;线粒体膜电位及ATP水平检测线粒体功能;流式细胞仪分析检测凋亡;胰岛素定量检测试剂盒检测胰岛素分泌量;实时定量反转录检测Sirt1、Pdx1、Glut2的表达水平;蛋白免疫印迹检测相应蛋白水平。结果与常氧对照组相比,低氧组细胞增殖降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.01),线粒体功能降低(P<0.05),胰岛素分泌减少(P<0.05),Sirt1、Pdx1、Glut2基因及其相应蛋白表达水平降低(P<0.05)。而白藜芦醇干预可以明显减轻低氧应激损伤(P<0.05),促进增殖(P<0.05),逆转凋亡(P<0.01),改善线粒体功能(P<0.05),促进胰岛素分泌(P<0.05),促进Sirt1、Pdx1、Glut2基因及其相应蛋白表达水平(P<0.05)。结论白藜芦醇可以保护低氧造成的INS-1细胞氧化应激损伤,改善线粒体功能,抗凋亡,并促进胰岛素功能性基因表达,促进胰岛素分泌。

逍遥散含药血清影响RIN-m5f细胞活性及胰岛素分泌的机制探讨

目的研究逍遥散含药血清对应激损伤状态糖尿病细胞模型[大鼠胰岛β细胞瘤细胞(RIN-m5f)]的活性、胰岛素(INS)分泌的影响及其干预机制。方法用高浓度葡萄糖(50mmol·L^-1)和皮质酮(CORT,320μmol·L^-1)诱导培养RIN-m5f细胞12h,制备应激损伤状态糖尿病细胞模型,再用30%逍遥散含药血清干预,并设立空白血清对照。共分为7组:①正常组:RIPM1640+10%FBS;②高糖组(G组):①+50mmol·L^-1的葡萄糖;③应激组(GCo组):②+320μmol·L^-1的CORT;④空白血清高糖组(GC组):②+30%空白组大鼠血清(30%C)⑤逍遥散血清高糖组(GX组):②+30%逍遥散组大鼠血清(30%X);⑥空白血清应激组(GCoC组):③+30%C;⑦逍遥散血清应激组(GCoX组):③+30%X。干预12h后,采用CCK-8法检测细胞活性;酶联免疫法(ELISA)检测细胞INS分泌水平;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞活化转录因子6(ATF-6)、肌醇需酶1(IRE-1)mRNA表达;Western Blot法检测细胞Caspase-12、CHOP蛋白表达。结果与正常组比较,G组细胞活性和ATF6、IRE1 mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平显著下降(P<0.05,P<0.01),INS水平显著升高(P<0.01)。与G组比较,GCo组细胞活性显著降低(P<0.01),INS水平和ATF6、IRE1 mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平均明显上调(P<0.05,P<0.01)。与GC组比较,GX组的细胞活性明显升高(P<0.05),ATF6、IRE1mRNA以及Caspase-12蛋白表达水平均明显上调(P<0.05,P<0.01),但INS水平、CHOP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与GCoC组比较,GCoX组的细胞活性、INS水平明显升高(P<0.05),IRE1mRNA以及Caspase-12、CHOP蛋白表达水平明显下降(P<0.05,P<0.01),但ATF6mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论高浓度葡萄糖和CORT能降低应激损伤状态糖尿病RINm5f细胞的活性,升高INS水平,加重胰岛素抵抗(IR)程度。逍遥散含药血清能缓解细胞IR水平,其作用机制可能与调控内质网应激(ERS)相关。

青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞损伤的保护作用

目的:观察青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)损伤的保护作用。方法:用高糖诱导INS-1细胞损伤模型。MTT法检测青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物对INS-1细胞增殖的影响,荧光酶标仪检测青钱柳不同溶剂提取物对胞内活性氧(ROS)含量的影响,用ELISA法测定其胰岛素分泌能力,比色法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;比色法测定INS-1中Caspase-3、Caspase-9活性,荧光定量PCR测定Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2/Bax比率。结果:33 mmol/L葡萄糖处理INS-148 h后可见INS-1细胞数目明显减少、细胞边缘模糊、触角收缩聚集、形态变圆,LDH释放量增加,与正常对照组比较,培养液中的NO和细胞内的ROS、MDA含量、Caspase-3、Caspase-9活性和Bax mRNA表达明显升高,胰岛素分泌量和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性和Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显降低(P<0.01)。与模型对照组比较,用青钱柳不同溶剂提取物干预后INS-1细胞凋亡被显著抑制,培养液或细胞中NO、ROS、MDA含量,Caspase-3、Caspase-9活性,LDH释放量及Bax mRNA表达明显降低,胰岛素分泌和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性、Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显增加(P<0.05或者P<0.01)。结论:青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导INS-1细胞损伤有保护作用,其作用机制与增强内源性抗氧化系统功能、抑制线粒体依赖性凋亡密切相关;其作用效果由强到弱依次为青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物。