地榆皂苷Ⅰ对大鼠膝骨关节炎的作用机制研究

目的研究地榆皂苷Ⅰ对大鼠膝骨关节炎的作用机制。方法选择SD雄性乳鼠8只,提取乳鼠软骨细胞,采用CCK-8实验检测细胞增殖率以确定最佳药物浓度。将软骨细胞随机分为对照组、炎症组和治疗组,对照组在完全培养基中进行培养,炎症组在含有10μg/mL白细胞介素-1β(IL-1β)的培养基中培养,治疗组在含有10μg/mL IL-1β和最佳浓度地榆皂苷Ⅰ的培养基中培养。采用Calcein-AM/PI染色观察各组软骨细胞生长情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组软骨细胞中白细胞介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶13(MMP13)mRNA相对表达量。取8周龄左右的SD雄性大鼠24只随机分为对照组、炎症组和治疗组,每组8只,对炎症组和治疗组建立骨关节炎模型,建模完成4周后,炎症组和对照组的关节腔内注射等体积生理盐水,治疗组的关节腔内注射100μL最佳浓度的地榆皂苷Ⅰ溶液,1次/周,连续给药4周。采用HE染色和番红O-固绿染色观察各组膝关节组织结构。采用免疫组化染色观察各组膝关节组织中IL-6、MMP13蛋白表达情况。结果CCK-8实验结果显示,各实验浓度均未表现明显细胞毒性,当地榆皂苷Ⅰ的浓度为20 mg/L时,软骨细胞增殖率最高。Calcein-AM/PI染色结果显示,炎症组和治疗组细胞增殖率低于对照组,治疗组细胞增殖率高于炎症组,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-qPCR检测结果显示,炎症组和治疗组IL-6、MMP13 mRNA相对表达量高于对照组,治疗组IL-6、MMP13 mRNA相对表达量低于炎症组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色和番红O-固绿染色结果显示,对照组的膝关节组织结构比炎症组和治疗组完整,与炎症组相比,治疗组膝关节组织损伤有所减轻。免疫组化染色结果显示,炎症组IL-6、MMP13蛋白表达水平最高,治疗组IL-6、MMP13蛋白表达水平高于对照组。结论地榆皂苷Ⅰ可通过维持软骨细胞活力、降低炎症因子的释放以及减少软骨细胞外基质(ECM)的降解发挥抗炎作用,对膝骨关节炎有一定的药用潜力。

补肾通络方对大鼠膝骨关节炎膝关节软骨细胞外基质代谢的影响

目的探讨补肾通络方对膝骨关节炎大鼠的膝关节软骨中基质金属蛋白酶-3/13(matrix metalloproteinase-3/13,MMP-3/13)、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)m RNA和蛋白聚糖酶-1(aggrecanase-1即ADAMTs-4)蛋白的表达影响。方法将42只雄性Wistar大鼠随机分为7组:正常组,模型组,西药组,成药组,补肾通络方低、中、高剂量组,向大鼠双侧后肢膝关节腔内分别注射4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.2 mL,于第1、4、7天注射以建立膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)模型。造模成功后,分别以蒸馏水、美洛昔康水溶液、抗骨增生胶囊水溶液、补肾通络颗粒方低、中、高浓度水溶液对大鼠进行灌胃给药干预,干预过程中观察大鼠的一般状态,于灌胃给药干预4周后处死,并刮取双膝关节内胫骨平台及股骨内、外侧髁软骨组织,置于冻存管中备用,用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction,RTPCR)法测定软骨中MMP-3/13和TIMP-1在m RNA水平表达的变化及Western blot法测定ADAMTs-4蛋白表达情况。结果 MMP-3和MMP-13的m RNA表达情况在模型组最高(P<0.05),正常组表达最低(P<0.05),不同药物对其影响不同,其中补肾通络方的中剂量组表达水平在各给药组中最小,成药组表达含量在各给药组中最大,补肾通络方中剂量组与高剂量组相比,中剂量组表达低于高剂量组,然二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。TIMP-1的m RNA含量在模型组中最低(P<0.05),正常组中表达最多(P<0.05),在各给药组中补肾通络方高剂量组含量接近正常组,而低剂量组表达最少。软骨ADAMTs-4蛋白表达情况,模型组含量最高,正常组含量最低,各给药组之间含量不同,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论补肾通络方治疗KOA疗效明显,其作用机制可能是通过抑制MMP-3/13和ADAMTs-4的水平,增加TIMP-1的表达,减轻膝关节软骨的破坏情况,改善KOA的症状,从而达到治疗KOA的作用。

不同浓度补肾通络方对膝骨关节炎大鼠OPG/RANKL系统mRNA的影响

目的:观察不同浓度补肾通络方对膝骨关节炎大鼠模型膝关节软骨组织OPG/RANKL系统的影响,分析本方对KOA骨破坏/重建的作用机制。方法:采用膝关节腔内注射木瓜蛋白酶溶液法复制KOA模型,36只Wistar大鼠采用随机数字表法分为6组,分别为正常组、模型组、西药组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,观察不同浓度补肾通络方对KOA大鼠膝关节软骨组织OPG/RANKL系统mRNA表达水平的影响。结果:软骨OPG的mRNA水平是在模型组中含量最低(P<0.05),正常组中含量最高(P<0.05),中药中剂量组含量接近正常组,而在低剂量组中表达最少,且中剂量组与高剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。RANKL的mRNA表达情况是模型组最高(P<0.05),正常组最低(P<0.05),不同浓度的中药对其影响不同,但中药高、中、低三个剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。二者的比值变化趋势与OPG相类似,以模型组最小,正常组最大,随着中药浓度的升高,其比值逐渐增加,且中剂量组与高剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:补肾通络方能够提高KOA大鼠软骨OPG的mRNA表达水平,降低RANKL水平,具有双向调节OPG/RANKL轴的作用。既可促进成骨,又可抑制或延缓破骨,维持KOA大鼠模型中OB/OC活动的平衡,改善骨质代谢水平,缓解KOA病情进一步进展。

大鼠滑膜组织中S100A12、IL-1β、Galectin-3与早期膝骨关节炎相关性研究

目的检测早期膝骨关节炎大鼠滑膜组织中的S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达,探讨大鼠滑膜组织中三种炎性细胞因子与早期膝骨关节炎相关性的研究。方法 28只成年雄性Wistar大鼠,随机数字表法分成对照组、实验组。实验组大鼠采用左膝关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导早期膝骨关节炎;对照组大鼠相同方法及部位注射等量生理盐水。分别于造模成功后第1、28天提取大鼠滑膜组织,采用免疫组化法和酶联免疫吸附法检测滑膜组织中的S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达。结果①实验组造模成功后第1天检测S100A12、IL-1β、Galectin-3水平表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);②实验组造模成功后第28天检测S100A12、IL-1β水平表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但Galectin-3水平表达仍较明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论滑膜组织中S100A12、IL-1β、Galectin-3三种炎性细胞因子均与早期膝骨关节炎密切相关,为临床早期诊断膝骨关节炎提供理论依据,同时明确Galectin-3在早期膝骨关节炎病情进展中的持续表达。