依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

目的:探讨依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。方法:选择成年雄性SD大鼠40只,随机选8只为正常照组,其余32只采用动脉夹夹持法损伤视神经建立视神经损伤模型并分组,即模型组(视神经损伤大鼠),依托咪酯低、中、高剂量组(依托咪酯腹腔注射),剂量分别为2、4、6 mg/kg。分析比较干预后各组大鼠眼压变化。并行HE染色观察视网膜组织结构,比较各组大鼠视网膜神经节细胞(RCGs)存活数目及存活率,Western blot法检测视网膜组织中Caspase-3、BDNF蛋白表达。结果:模型组、依托咪酯各组眼压高于正常组,依托咪酯各组末次给药后眼压降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。模型组大鼠视网膜水肿增厚,以神经纤维层最为明显,且有空泡,RGC细胞肿胀,内、外核层细胞数量减少,排列紊乱。依托咪酯各组视网膜病理损伤均有改善,高剂量组好于中剂量组,中剂量组好于低剂量组。与正常组比较,模型组大鼠RCGs存活数目减少(P<0.05),与模型组比较,依托咪酯各组RCGs存活数目增多(P<0.05)。依托咪酯高剂量组RCGs存活数目、相对存活率高于中、低剂量组(均P<0.05)。正常组大鼠视网膜组织中BDNF蛋白表达高于模型组,Caspase-3低于模型组,依托咪酯各组视网膜组织中BDNF升高,Caspase-3下降,均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论:Caspase-3蛋白在大鼠视神经损伤中表达升高,BDNF蛋白表达降低,依托咪酯干预能够促进视网膜RGCs存活,对视神经损伤具有保护作用。

藏红花素通过跨膜受体蛋白/发状分裂相关增强子1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl_(2))处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Cal⁃pain1)蛋白表达情况。结果藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,差异有统计学意义(P<0.05);藏红花素+DAPT组细胞活力0.50±0.06低于藏红花素组0.83±0.08,细胞凋亡率(36.50±3.50)%高于藏红花素组(17.92±1.21)%,钙离子水平0.65±0.05高于藏红花素组0.27±0.04,差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧组比较,藏红花素组Bcl-2蛋白表达水平升高,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与藏红花素组比较,藏红花素+DAPT组Bcl-2蛋白表达水平降低,Notch1、Hes-1mRNA表达、Bax和Calpain1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论藏红花素对体外培养的缺氧RGC-5细胞凋亡有一定的抑制作用,可能是通过抑制钙离子内流,阻滞Notch1/Hes-1通路,提高细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平发挥作用。

GPER抑制星形胶质细胞活性减少OIR小鼠视网膜新生血管生成的机制研究

目的探究在氧诱导下的新生小鼠视网膜缺血模型(oxygen-induced retinopathy,OIR)中,G蛋白偶联雌激素受体(G proteincoupled estrogen receptor,GPER)减少OIR小鼠视网膜新生血管生成的机制。方法42只新生小鼠采用随机数字表法分为4组:常氧对照组(n=11)、OIR组(n=11)、G-1(GPER激动剂)组(n=10)和溶剂对照组(n=10)。出生后17 d(P17)时,眼球冰冻切片免疫荧光染色观察常氧对照组小鼠GPER在视网膜分布情况。G-1组和溶剂对照组在P12~P15时分别腹腔注射给予G-1[50μg/(kg·d)]或玉米油溶剂,P17时视网膜铺片免疫荧光染色观察视网膜血管标志物(IB4)、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glia fibrilary acidic protein,GFAP)表达,蛋白免疫印迹法定量检测视网膜血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、GFAP、炎症因子TNF-α、IGF-1、IL1-β蛋白表达情况。结果GPER存在于小鼠视网膜全层,在视网膜神经节细胞层与星形胶质细胞标志物GFAP共染。与常氧对照组相比,OIR组小鼠视网膜出现新生血管与无血管区,且GPER、VEGFA和GFAP表达增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与溶剂对照组相比,G-1组视网膜新生血管生成减少,VEGFA、GFAP、TNF-α、IGF-1、IL1-β蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论GPER能抑制星形胶质细胞活性,减少VEGFA、炎症因子释放,减少OIR小鼠视网膜新生血管生成。

依那西普对糖尿病视网膜病变大鼠神经元细胞凋亡及Fas、caspase-8表达的影响

[目的]探讨依那西普对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠神经元细胞凋亡及Fas、caspase-8表达的影响.[方法]30只SPF级SD大鼠随机分为对照组、模型组、依那西普组,每组10只.依那西普组大鼠DR建模成功后在大腿前侧皮下注射0.4mg/kg依那西普溶液,1次/d,连续8周;对照组及模型组在同时间腹腔注射等量pH4.5的0.01 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液.药物干预结束后,原位末端标记(TUNEL)技术检测各组大鼠视网膜神经元细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(AI);检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)水平;免疫印迹法检测各组大鼠视网膜组织中Fas、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)蛋白水平.[结果]模型组及依那西普组大鼠神经元细胞出现凋亡现象.与对照组比较,模型组、依那西普组大鼠神经元细胞AI、血清SOD活性及视网膜组织中Fas、caspase-8蛋白水平均升高(P<0.05),血清MDA、ROS水平均降低(P<0.05);依那西普组大鼠神经细胞AI、血清SOD活性、视网膜组织中Fas、caspase-8蛋白水平低于模型组(P<0.05),血清MDA、ROS水平高于模型组(P<0.05).[结论]依那西普可能通过抑制DR大鼠神经元细胞氧化应激反应,抑制Fas/caspase-8通路活化,进而抑制神经元细胞凋亡.

姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响及机制

目的:探讨姜黄素对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及机制。方法:将21只SD大鼠随机分为3组,每组7只,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠通过烧灼巩膜上静脉法建立慢性高眼压模型,假手术组大鼠仅剪开球结膜,不烧灼巩膜上静脉;姜黄素治疗组给予4mL/kg姜黄素灌胃,假手术组和高眼压模型组给予4mL/kg纯水灌胃,连续3wk。造模后3wk,采用HE染色观察各组大鼠视网膜组织形态病理变化、RGCs数量及神经节细胞层(GCL)厚度;采用TUNEL染色观察各组大鼠RGCs和视网膜细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色和Western blot法检测各组大鼠视网膜谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)与血红素加氧酶-1(HO-1)的表达水平。结果:与假手术组相比,高眼压模型组和姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态紊乱,RGCs数量减少,GCL变薄,RGCs和视网膜细胞凋亡率均升高,GCLM和HO-1表达量均升高;与高眼压模型组相比,姜黄素治疗组大鼠视网膜组织形态基本正常,RGCs数量增多,GCL增厚,RGCs和视网膜细胞凋亡率均降低,GCLM和HO-1表达量均升高。结论:姜黄素在慢性高眼压大鼠模型中可通过上调抗氧化基因GCLM与HO-1的表达抑制RGCs凋亡。

高良姜素对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究高良姜素对青光眼大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用。方法取48只SD大鼠随机分为对照组、对照+高良姜素组、高眼压组和高眼压+高良姜素组,每组12只(12眼)。对照+高良姜素组和高眼压+高良姜素组大鼠接受高良姜素滴眼液治疗,对照组和高眼压组大鼠则接受相同剂量二甲基亚砜溶剂滴眼。于造模后第0~28天监测大鼠眼压,并于造模后第28天处死大鼠,收集各组大鼠右眼球,并采用HE染色观察大鼠视网膜形态变化,采用免疫组织化学染色分析各组大鼠视网膜中GFAP、Toll样受体4(TLR4)和NOD样受体3(NLRP3)表达。从4只4 d龄大鼠视网膜中分离RGC,分为空白组、光气组和CoCl 2+高良姜素组。光气组和光气+高良姜素组RGC与200μmol·L-1 CoCl 2一起孵育48 h,光气+高良姜素组RGC中加入20μmol·L-1高良姜素干预48 h。收集各组细胞,采用流式细胞术和Western blot检测RGC的凋亡率及相关蛋白的相对表达情况,并采用ELISA检测空白组、光气组和光气+高良姜素组RGC中IL-18和IL-1β蛋白表达。结果造模后第3~28天,与对照组比较,高眼压组大鼠眼压均显著升高(均为P<0.001),高眼压+高良姜素组大鼠眼压差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后第0~28天,对照组与对照+高良姜素组大鼠眼压差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后第18~28天,与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠眼压均持续显著降低(均为P<0.05)。对照组大鼠视网膜厚度、RGC生存率与对照+高良姜素组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);与对照组比较,高眼压组大鼠视网膜厚度、RGC生存率均显著减少(均为P<0.01),高眼压+高良姜素组大鼠视网膜厚度、RGC生存率差异均无统计学意义(均为P>0.05);与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠视网膜厚度、RGC生存率均显著增加(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组比较,高眼压组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著上调(均为P<0.001),高眼压+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著降低(均为P<0.001),对照+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达差异无统计学意义(均为P>0.05);与高眼压组比较,高眼压+高良姜素组大鼠视网膜组织中TLR4、NLRP3蛋白表达均显著降低(均为P<0.01)。在体外实验中,与空白组比较,光气组RGC中IL-18和IL-1β表达均显著增加(均为P<0.05);与光气组比较,光气+高良姜素组RGC中IL-18和IL-1β表达均显著减少(均为P<0.001);光气组RGC中TLR4、NLRP3蛋白表达较空白组均显著增加(均为P<0.001);且光气+高良姜素组RGC中TLR4、NLRP3蛋白表达较光气组均显著减少(均为P<0.01)。结论高良姜素在青光眼模型中可降低眼压并防止RGC凋亡,其保护机制可能与抑制TLR4/NLRP3炎症小体激活有关。

新生大鼠视网膜神经元及节细胞体外短期培养方法

目的 建立新生大鼠视网膜神经元原代培养体系 ,观察视网膜神经元和神经节细胞 (retinalganglioncells,RGC)在体外短期培养的生长特点。方法 将新生大鼠视网膜细胞悬液接种于预先用鼠尾胶原包被的 96孔细胞培养板中 ,按 4 0 0× 10 3 ·cm-2 (高密度 )及 2 0 0× 10 3 ·cm-2 (低密度 ) 2种密度接种 ,抑制非神经元生长 ,MTT比色法评价细胞活力 ;上述细胞悬液按高密度接种于 2 4孔细胞培养板中 ,进行HE染色和Thy1单克隆抗体的免疫化学染色 ,测量视网膜神经元和RGC轴突的长度。结果 视网膜神经细胞有聚集成簇生长的倾向 ,细胞活力在高密度培养时明显高于低密度培养 ;第 3天细胞活力最高 ;视网膜神经元在体外形态多样 ,最初 2d轴突生长速度最快 ,超过 12 .0 μm·d-1;大多数RGC从第 1天就再生出 2个或 2个以上的突起 ,第 1天的平均轴突长度为 12 .5 μm·d-1,从第 2天起保持在8 0 μm·d-1。第 4天的平均轴突长度为 2 9.4 5 μm。结论 以鼠尾胶原为支持物 ,经过酶消化法得到的新生大鼠视网膜神经元 ,包括RGC ,能够在短期内表现出较高的细胞活力并再生出较长的轴突 ;高密度培养 ( 4 0 0× 10 3 ·cm-2 )更有利于视网膜神经元在体外生长存活。

促红细胞生成素对大鼠视网膜神经元谷氨酸损伤的保护作用

目的探讨促红细胞生成素对大鼠视网膜神经元谷氨酸损伤的保护作用。方法原代培养大鼠视网膜神经元,透射电镜和LDH释放率检测评价不同浓度谷氨酸对神经元的影响,并选择损伤明显的浓度作为损伤剂量。然后细胞分组为N组(正常对照)、G组(谷氨酸损伤)、EG组(EPO+谷氨酸)、AG组(AG490+谷氨酸)、AEG组(AG490+EPO+谷氨酸)、MTT比色法比较5组神经元活力的改变。Western blot检测各组细胞Bax蛋白表达的情况。结果透射电镜显示在50μmol·L-1组出现了染色质和线粒体的改变。100μmol·L-1组改变更加明显。LDH释放率结果显示在20μmol出现了明显的细胞损害。MTT结果示EG组细胞活力高于G、AG和AEG组,G组高于AG和AEG组(P<0.01)。Western blot检测结果示,AG、AEG组Bax表达高于G组,G组高于EG组。结论 EPO对视网膜神经元谷氨酸损伤有保护作用,保护机制可能通过Jak2通路下调神经元谷氨酸损伤后Bax蛋白的表达,减少细胞凋亡从而达到视网膜神经元保护作用。

SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。

Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型葡萄糖浓度和培养时间的筛选

目的筛选Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型的葡萄糖浓度及培养时间。方法取出生1~3 d Wistar大鼠分离视网膜神经元进行传代培养,尼氏染色法鉴定细胞;实验分5组:A组培养液葡萄糖浓度为0 mmol·L^(-1)(正常对照组),B组浓度为10 mmol·L^(-1),C组浓度为15 mmol·L-1,D组浓度为25 mmol·L^(-1),E组浓度为35 mmol·L^(-1)。分别培养24 h、48 h、72 h后用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果倒置显微镜观察分离培养细胞,大部分细胞于接种24 h后贴壁,少数细胞长出较短的突起,并有向中央聚集生长的现象。2~3 d后长出突起的神经元数目增多,突起长度增加,约为自身胞体长度的1倍。培养5~7 d后神经元突起进一步增多、变长。经尼氏染色后细胞质呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状结构清晰。非神经元细胞胞质基本不着色,细胞核呈淡紫色、圆形,核仁清晰可辨,神经元率达91%。各实验组在培养24 h后OD值均低于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。随培养时间延长OD值继续下降,48 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组OD值明显下降,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05),E组下降更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。72 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。各组在培养24 h后视网膜神经元凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。48 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组凋亡率明显升高,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05);E组凋亡率升高更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01),且与D组比较亦有统计学意义(P<0.05)。72 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05),D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。结论葡萄糖浓度为25 mmol·L^(-1)培养48 h是视网膜神经元高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间。

N-甲基-D-天门冬氨酸对大鼠视网膜神经节细胞层神经元的损伤作用

目的 探讨N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)对大鼠视网膜神经节细胞层(RGCL)神经元的毒性作用。方法 通过大鼠玻璃体内注入不同浓度的NMDA,观察注射前后不同时间视网膜神经节细胞层的神经元计数。结果 大鼠RGCL神经元计数随NMDA浓度增加及时间延长而逐渐减少。其中以大神经元对NMDA兴奋毒性最敏感。结论NMDA可导致RGCL神经元损伤,并显示以大神经元最先受损,即与青光眼性视神经损伤相似,此模型可应用于研究青光眼性视神经损伤机制。

小分子组合诱导大鼠胚胎成纤维细胞重编程为功能性神经元

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞。方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质。结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%。包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%。以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC。其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少。神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少。结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC。

活化的巨噬细胞对大鼠晶状体损伤后视神经损伤修复的影响

目的:探讨活化的巨噬细胞对大鼠晶状体损伤后视神经损伤修复的影响。方法:选用普通级成年健康Wistar大鼠45只,随机平均分为3组:正常对照组不做任何处理;NC组给予视神经横断性损伤;NC+LP组先给予视神经横断性损伤,再给予晶状体损伤。术后第7、14、21天每组分别处死大鼠5只,免疫组化染色方法检测视网膜组织中ED-1的表达,免疫荧光法检测GAP-43的表达。结果:术后第7、14、21天,正常对照组及NC组视网膜中均未见ED-1阳性细胞;NC+LP组ED-1阳性细胞计数分别为(58.27±4.79)、(45.39±5.13)、(21.17±3.40),第7天时表达最强,之后降低(P<0.001)。术后第7天NC组神经节细胞层可见少量GAP-43表达,高于正常对照组,之后表达降低;NC+LP组各时间点GAP-43表达均大于NC组(P<0.05),术后第14天表达最强(P<0.05)。结论:激活巨噬细胞可促进晶状体损伤后视神经轴突再生。

左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究

目的研究左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法通过STZ诱导建立I型糖尿病大鼠模型,成模后采用灌胃方式给予不同剂量的左卡尼汀口服液,6周后行电镜观察,比较疾病模型组与治疗组之间视网膜节细胞的超微结构变化,并进行DNA末端转移酶介导缺口末端标记(TUNEL)染色,观察细胞的凋亡情况。结果电镜显示药物治疗组神经节细胞核异染色质及线粒体空泡化较对照组减少,200 mg·kg-1的治疗剂量效果优于100 mg·kg-1组(P<0.05)。药物治疗组减少了由糖尿病导致的视网膜神经节细胞的凋亡数目(P<0.05)。结论左卡尼汀对糖尿病大鼠模型视网膜节细胞具有保护作用,抗凋亡可能是作用机制之一。

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的 建立LongEvans大鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)体外培养的方法 ,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法 出生后 1～ 3d的LongEvans大鼠视网膜神经上皮层 ,胰蛋白酶 +透明质酸酶消化制成单细胞悬液 ,用DMEM培养液进行培养 ,观察细胞生长规律 ,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度 ,Thy1 1单克隆抗体和微管相差蛋白 2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs。结果 LongEvans大鼠RGCs体外培养存活 4d ;荧光双标显示RGCs纯度为 80 %～ 90 %。结论 在普通培养基中LongEvans大鼠RGCs体外培养能获成功。胰蛋白酶

促红细胞生成素预处理对视网膜神经元缺氧性损伤的保护作用

目的研究缺氧对培养大鼠视网膜神经元的影响及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)预处理的保护作用。方法取体外原代培养3d的大鼠视网膜神经元,利用1mmol.L-1的连二亚硫酸钠消除培养基中的氧合并培养基质缺糖持续6h,导致神经元缺氧性损伤。采用免疫组化染色技术检测了EPO受体在原代培养视网膜神经元的表达,乳酸脱氢酶(LDH)释放率作为评价损伤的指标,TUNEL染色检测视网膜神经元的凋亡,并进行形态学观察。结果原代培养的大鼠视网膜神经元正常下可见EPOR的弱阳性表达,表达部位定位于神经元的胞体和突起,缺氧后EPOR的表达明显增加;神经元LDH释放率和凋亡百分率增加;在损伤前加入浓度2.5～40kU.L-1的rhEPO均可有效抑制LDH释放(P<0.05)。TUNEL结果显示rhEPO预处理能抑制神经元的凋亡,明显改善细胞缺氧性损伤的形态学变化。结论EPO预处理对神经元的缺氧损伤具有保护作用,且具有浓度和时间依赖性。

依托咪酯对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察依托咪酯(ET)对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(RGC)存活的作用。方法:成年雌性SD大鼠42只,眶内距视神经根部1mm处切断左侧视神经,残端留置浸有荧光金(50g/L)的明胶海绵逆行标记RGC。术后大鼠随机分为ET(4mg/kg,ip,1次/d)治疗组、1,2-丙二醇(PG)溶剂对照组、生理盐水对照组和正常对照组。再根据术后不同存活时间将前3组动物分为7d和14d两个亚组,正常对照组动物则存活2d。于相应存活时间点处死动物,取出各组大鼠左侧视网膜平铺后计数存活RGC并得出RGC的平均密度。结果:术后7dET治疗组存活RGC平均密度为1307±55/mm2,显著高于PG对照组(1128±75/mm2)和生理盐水对照组(1068±75/mm2,P<0.001)。然而,未能在术后14d观察到ET的这种保护作用,因为ET治疗组存活RGC平均密度(210±36/mm2)与PG对照组(215±20/mm2)和生理盐水对照(208±19/mm2)间无显著差异(P>0.05)。结论:ET在视神经切断后一定时期内对RGC具有神经保护作用。

银杏叶提取物对培养大鼠视网膜神经细胞的保护作用

目的观察银杏叶提取物(EGb761)对大鼠视网膜神经细胞线粒体膜电位(MMP)的影响及其对抗谷氨酸兴奋性毒性对视网膜神经细胞的保护作用。方法培养视网膜神经细胞,用Rhodamine123标记培养7d的视网膜神经细胞线粒体,分为正常对照组、EGb761组、谷氨酸组以及EGb761+谷氨酸组,共聚焦激光显微镜动态检测MMP的变化。结果与正常对照组比较谷氨酸组MMP下降;EGb761组MMP及EGb761+谷氨酸组MMP升高,P<0.01。结论EGb761可能通过升高视网膜神经细胞MMP的途径影响线粒体的功能;并且可对抗谷氨酸兴奋性毒性,保护视网膜神经细胞。

人参皂苷Rg1对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察人参皂苷Rg1对成年大鼠视神经挤压伤后视网膜神经节细胞(RGCs)存活的作用。方法:取成年雄性Wistar大鼠30只,眶内距视神经根部2mm处用Yasargil动脉瘤夹夹持左侧视神经30s,术后5d在大鼠左侧上丘注射荧光金标记RGCs。将大鼠随机分为Rg1治疗组和生理盐水对照组。根据不同存活时间将每组动物再分为伤后第7、14和21天3个亚组,每个亚组5只;另取5只作为正常对照组。于相应存活时间点处死各组动物,取出各组大鼠左侧视网膜平铺后计数存活RGCs并计算出RGCs的平均密度。结果:正常对照组RGCs平均密度为2268±100/mm2。视神经挤压伤后RGCs急剧减少,伤后第7、14和21天分别减少至1301±105/mm2、760±/60mm2和648±65/mm2。Rg1治疗组存活RGCs平均密度均显著高于生理盐水对照组,伤后第7、14和21天分别为1748±98/mm2、1030±68/mm2和840±71/mm2(P<0.05)。结论:Rg1在视神经挤压伤后对RGCs具有显著神经保护作用。

新生大鼠视网膜神经元的原代培养与观察

目的：建立新生大鼠视网膜神经元体外培养的有效方法。方法：取出生后1～3d的Wistar大鼠视网膜，胰蛋白酶＋依地酸（EDTA）消化制成单细胞悬液，接种于置有包被多聚赖氨酸（poly-L-lysine）玻片的24孔培养板中培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对视网膜神经元进行染色。结果：在多聚赖氨酸上培养的视网膜神经元生长良好，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经丝蛋白（NF）抗体反应阳性。胰蛋白酶＋EDTA联合消化能使视网膜细胞很好得分离，获得视网膜单细胞悬液。结论：酶消化法原代培养视网膜神经元有较好的视网膜神经元生长率；胰蛋白酶＋EDTA联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好。