化合物M-286对AGE诱导大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的观察化合物M-286对糖基化终产物(advanced glycosylation end product,AGE)诱导视网膜血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cell,RMEC)凋亡的影响。方法体外培养RMEC,以不同浓度的化合物M-286培养液作用于AGE处理的RMEC,MTT法检测RMEC存活率,流式细胞术检测凋亡细胞比例及细胞内ROS含量。结果不同浓度的化合物M-286可在不同程度上保护AGE处理后的RMEC,与AGE组比较,能够明显提高细胞存活率(P<0.05)。与空白对照组比较,AGE处理24 h后RMEC凋亡比例明显升高;不同浓度的化合物M-286处理后细胞凋亡比例均有所下降,与AGE组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);AGE处理24 h后,ROS水平明显升高,化合物M-286可降低AGE处理后细胞内ROS水平,与AGEs组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论化合物M-286可通过抑制AGE诱导RMEC中ROS的产生,减少RMEC凋亡。

雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的观察雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响。方法将体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞分为空白对照组、高糖组、高糖+雷公藤红素(0.05mg·L-1)组,进行相应处理后分别用免疫细胞化学及ELISA法检测细胞中VEGF和PEDF的表达。结果免疫细胞化学灰度值测定,空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达分别为74.40±4.19、110.12±7.32、78.11±5.81,PEDF表达量分别为124.65±6.01、88.73±7.84、93.31±5.67;ELISA结果显示空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达量分别为(155.21±13.36)ng·L-1、(237.69±19.41)ng·L-1、(168.57±26.32)ng·L-1,PEDF表达量分别为(251.37±17.95)ng·L-1、(178.35±25.36)ng·L-1、(191.58±31.37)ng·L-1,与正常对照组相比,高糖组VEGF表达增高(P<0.05),PEDF表达减少(P<0.05);与高糖组相比,高糖+雷公藤红素组VEGF表达减少(P<0.05),PEDF表达无明显差异性(P>0.05)。结论雷公藤红素能减少高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞中VEGF表达,对PEDF表达的影响不明显。

红参对糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子表达及神经节细胞凋亡的影响

目的:通过观察糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在视网膜表达的变化,探讨红参对RGCs凋亡及VEGF表达的影响以及后两者之间的关系。方法:链脲佐菌素诱导实验性DM大鼠模型,造模成功的DM大鼠随机分为模型组(n=10)和治疗组(n=10),并与未造模的正常组大鼠进行比较。治疗组以红参粉末灌胃给药,1次/d。TUNEL法检测RGCs凋亡并计数RGCs凋亡数量。LSAB法检测VEGF在视网膜的表达,图像分析仪检测免疫组化的显色强度,定量分析。结果:与正常组相比,DM大鼠RGCs凋亡数量显著增加(P<0.01);与模型组相比,治疗组RGCs凋亡数量显著减少(P<0.05)。与正常组相比,DM大鼠视网膜VEGF的表达增强;与模型组相比,LSAB法标记染色的VEGF在治疗组表达减弱。结论:红参能抑制DM大鼠视网膜VEGF的表达,减少DM大鼠RGCs的凋亡,DM大鼠RGCs凋亡数量与VEGF在视网膜表达呈正相关。

雷公藤红素对大鼠视网膜血管内皮细胞增生和凋亡的影响

目的观察雷公藤红素对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(mouse retinal vascular endothelial cells,MRECs)增生和凋亡的影响。方法体外原代培养MRECs,通过免疫细胞化学方法检测FⅧr-Ag从而鉴定培养的MRECs;使用不同浓度的雷公藤红素(0.01mg·L-1、0.02mg·L-1、0.05mg·L-1、0.10mg·L-1、0.20mg·L-1、0.50mg·L-1)作用于原代培养的MRECs 24h、48h、72h,分别使用MTT法和流式细胞术观察其对MRECs增生和凋亡的影响。结果雷公藤红素0.02mg·L-1以上时,吸光度A值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。作用24h细胞增生抑制率分别为(8.62±4.23)%、(24.41±6.27)%、(46.51±5.95)%、(65.62±9.21)%、(72.83±8.24)%、(74.69±11.26)%;作用48h细胞增生抑制率分别为(9.34±3.78)%、(26.21±7.35)%、(51.36±6.39)%、(66.59±8.99)%、(73.19±10.24)%、(76.16±15.21)%;作用72h细胞增生抑制率分别为(11.24±4.62)%、(32.69±7.21)%、(55.28±10.25)%、(70.22±9.34)%、(75.84±13.69)%、(78.93±10.76)%。流式细胞术结果分析显示,当雷公藤红素浓度为0.05mg·L-1时,MRECs的凋亡率为(8.42±1.07)%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论雷公藤红素对体外培养的MRECs的增生有抑制作用,并能诱导细胞的凋亡。

组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞

目的利用组织块半悬浮培养法分离培养大鼠视网膜血管内皮细胞。方法分离大鼠视网膜并剪碎,将4~5个碎块半悬浮培养,培养基为含有体积分数10%胎牛血清并滴加重组牛碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液,获得的细胞用Ⅷ因子相关抗体鉴定,并使用传统冻存及复苏的方法保存。结果 24 h组织块生长固定在培养皿中,6 d可见细胞从组织块边缘游出,并可见多个细胞集落,16 d基本铺满培养皿。Ⅷ因子相关抗体染色阳性,细胞可持续生长并传代。结论用组织块半悬浮培养法可以简便的获得视网膜血管内皮细胞,所获细胞性状稳定,可用于进一步实验研究。

薯蓣皂苷调控miR-146a表达抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞损伤机制研究

目的探讨薯蓣皂苷对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞(RRVEC)损伤的保护作用及作用机制。方法采用不同浓度薯蓣皂苷干预高糖诱导RRVEC细胞以及构建miR-146a过表达的RRVEC细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot法检测凋亡相关蛋白表达,流式细胞仪检测ROS相对含量,酶联免疫吸附法检测MDA含量和SOD活性,qRT-PCR检测miR-146a表达。结果高糖诱导的大鼠RRVEC细胞miR-146a呈低表达。薯蓣皂苷干预、过表达miR-146a均可降低高糖诱导的大鼠RRVEC细胞凋亡率(P<0.05),促进高糖诱导的RRVEC细胞Bcl-2蛋白表达,抑制Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表达(P<0.05),降低ROS水平和MDA含量(P<0.05),提高SOD活性(P<0.05)。薯蓣皂苷干预还能促进miR-146a表达,抑制miR-146a表达逆转了薯蓣皂苷(30μg/ml)对高糖诱导的RRVEC损伤的影响。结论薯蓣皂苷通过调控miR-21表达抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞损伤。

基质细胞衍生因子-1对大鼠视网膜血管内皮细胞功能的影响及其与MAPK/Erk信号通路的关系

目的探讨基质细胞衍生因子(SDF)-1及MAPK/Erk信号通路抑制剂U0126对体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞(MRVEC)增殖的影响。方法体外培养的MRVEC采用0、25、50和100μg/L的SDF-1处理,100μg/L SDF-1处理体外培养的MRVEC细胞0、24、48和72 h,采用Western印迹方法检测MRVEC细胞中MAPK/Erk信号通路的磷酸化活化情况,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测MRVEC细胞的增殖情况。采用MAPK/Erk信号通路抑制剂U0126预处理MRVEC细胞,观察MAPK/Erk信号通路在SDF-1调控MRVEC细胞增殖中的作用。结果与100μg/L的SDF-1处理组相比,25、50和100μg/L的SDF-1均可显著上调MRVEC细胞中Erk的磷酸化水平,加强MRVEC细胞的增殖能力(P<0.01),且这种作用具有剂量依赖性。采用Erk信号通路阻断剂U0126阻断MRVEC细胞中的Erk信号通路后,SDF-1促MRVEC细胞增殖的能力显著降低(P<0.01)。结论胰岛素可通过激活MRVEC细胞中的MAPK/Erk信号通路,进而增强MRVEC细胞的增殖能力,从而在糖尿病视网膜病变中发挥一定的作用。

PEDF对大鼠视网膜血管内皮细胞迁移及VEGF表达的影响

目的:观察PEDF对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及VEGF蛋白表达的影响,初步探讨PEDF抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法:采用细胞划痕实验测定PEDF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移的影响;RT-PCR检测PEDF刺激后15,30,45,60min大鼠视网膜微血管内皮细胞的VEGF水平的变化。结果:PEDF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移具有抑制作用,且可抑制VEGF对糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞促迁移作用,呈剂量依赖性。结论:PEDF抑制糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞的迁移,其作用可能与VEGF水平有关。

葡萄糖转运蛋白-1在不同血糖浓度糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞中的表达

①目的探讨葡萄糖转运蛋白-1在早期不同血糖浓度组糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞中的表达及其在发生与发展中的作用：②方法以健康雄性SD大鼠建立链脲佐菌素糖尿病模型，用胰岛素使其血糖分别控制在〈10、10～14、〉16．7mmol／13个不同水平，在制模成功后12周时处死大鼠，取眼球组织，用免疫组化方法检测对照组和糖尿病组大鼠视网膜血管内皮细胞中葡萄糖转运蛋白-1（CLUT—1）的表达变化，取血，通过比色法和放免法测定血中T-AOC和ET—1的含量。③结果结果发现，轻度高血糖可引起视网膜组织中GLUT-1的表达升高，严重高血糖可降纸GLUT—1的表达；血中T—AOC含量随血糖升高而降低，ET—1含量随血糖升高而增高。④结论GLUT-1的表达随血糖浓度的适应性变化可在一定程度上保护血管内皮细胞，而且T—AOC和ET—1的含量变化也说明细胞仍然发生了损伤。

miR-96-5p靶向FOXO4对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨微小RNA-96-5p(miR-96-5p)对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:体外培养SD大鼠视网膜血管内皮细胞(RRVEC)进行实验,将细胞分为对照组(NG)、高糖组(HG),收集高糖诱导的细胞,分别或共同转染miR-96-5p模拟物(mimic)、无义miRNA(miR-NC)、FOXO4 siRNA(si-FOXO4)、FOXO4阴性对照序列(si-NC)、pcDNA-FOXO4、pcDNA。分别采用qRT-PCR与Western blotting检测miR-96-5p与FOXO4的表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证miR-96-5p的靶基因;Western blotting检测细胞中CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspased-3蛋白表达。结果:高糖处理后,RRVEC中miR-96-5p、CyclinD1、Bcl-2表达水平均显著降低,而FOXO4、p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表达水平显著升高,抑制细胞增殖活性,促进细胞凋亡;miR-96-5p过表达与抑制FOXO4表达后CyclinD1、Bcl-2表达水平显著升高,抑制p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表达,增强细胞增殖能力,抑制细胞凋亡;双荧光素酶报告实验证明,FOXO4是miR-96-5p的靶基因;FOXO4过表达可逆转miR-96-5p过表达对高糖诱导的RRVEC增殖和凋亡的作用。结论:miR-96-5p通过靶向FOXO4以抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡并促进细胞增殖。

TRPC3对OIR小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞生物学行为的调控作用

目的探讨瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员3(TRPC3)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜和人视网膜血管内皮细胞(HREC)生物学行为的调控作用。方法选取健康SPF级7日龄C57BL/6小鼠32只,采用随机数字表法分为对照组和OIR组,每组16只,其中对照组不做特殊处理,OIR组小鼠诱导OIR模型。出生后第17天(PN17)采用视网膜铺片免疫荧光染色验证模型构建是否成功。将体外培养HREC分为正常对照组、转染试剂组和si-TRPC3组,其中正常对照组不做特殊处理,转染试剂组和si-TRPC3组分别采用转染试剂和转染试剂+si-TRPC3转染。采用实时荧光定量PCR法检测TRPC3 mRNA相对表达量;采用Western blot法检测TRPC3、转录因子NF-E2相关因子(Nrf2)和超氧化物歧化酶(SOD)蛋白相对表达量。另将HREC分为正常对照组、血管内皮生长因子(VEGF)组、si-TRPC3组和Pyr3(TRPC3通道抑制剂)组,分别用完全培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基、含有20 ng/ml VEGF重组蛋白的培养基(si-TRPC3转染72 h)和含有20 ng/ml VEGF重组蛋白+1μmol/L Pyr3的培养基培养48 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测HREC增生能力;分别采用细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞横向和纵向迁移能力。结果PN17时OIR组小鼠视网膜出现病理性新生血管团簇强荧光染色。OIR组小鼠视网膜TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量分别为2.057±0.244和1.517±0.290,明显高于对照组的0.983±0.033和0.874±0.052,差异均有统计学意义(t=6.165、3.094,均P<0.05)。si-TRPC3组TRPC3 mRNA和蛋白相对表达量明显低于正常对照组和转染试剂组,Nrf2和SOD蛋白相对表达量明显高于正常对照组和转染试剂组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CCK-8实验结果显示,VEGF组细胞吸光度(A)值明显高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞A值明显低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,VEGF组细胞横向迁移率高于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组细胞横向迁移率低于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Transwell实验结果显示,VEGF组染色细胞数明显多于正常对照组,si-TRPC3组和Pyr3组染色细胞数明显少于VEGF组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论OIR模型小鼠视网膜中TRPC3表达水平升高,下调TRPC3可抑制HREC增生和迁移能力,其机制与Nrf2氧化应激通路激活有关。

胃饥饿素对高糖下视网膜微血管内皮细胞氧化应激及铁死亡的抑制作用

目的研究胃饥饿素对高糖下人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)氧化应激及铁死亡的影响。方法将体外培养的HRMEC分为对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组,分别采用常规培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖+10 nmol/L胃饥饿素培养基培养24 h。采用细胞计数试剂盒8检测细胞增生情况;采用流式细胞术检测细胞活性氧簇(ROS)水平;采用试剂盒检测细胞中氧化应激指标还原型谷胱甘肽(GSH)浓度、丙二醛(MDA)浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性及Fe^(2+)浓度;采用透射电子显微镜观察线粒体结构;采用Western blot法检测HRMEC中铁死亡关键分子谷胱甘肽过氧化合物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达。结果对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组细胞增生率分别为(100.62±3.40)%、(63.74±4.25)%和(88.19±4.65)%,ROS荧光强度分别为15512.20±1347.53、46457.00±1072.65和22220.87±1669.20,GSH浓度分别为(68.52±7.61)、(21.45±1.57)和(55.68±5.15)μmol/L,MDA浓度分别为(0.79±0.10)、(2.47±0.27)和(1.08±0.15)μmol/L,SOD活性分别为(111.67±10.32)、(37.75±5.92)和(97.45±9.12)U/ml,Fe^(2+)浓度分别为(3.02±0.30)、(9.45±0.71)和(4.63±0.32)mmol/mgprot。各组间细胞增生率、ROS荧光强度、GSH浓度、MDA浓度、SOD活性及Fe^(2+)浓度总体比较,差异均有统计学意义(F=61.82、414.59、61.28、67.24、61.64,146.14,均P<0.001);与对照组相比,高糖组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性均明显降低,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性明显升高,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组相比,高糖组细胞内线粒体铁死亡现象明显;与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组线粒体状态明显改善。各组间细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=63.94、182.84,均P<0.001);与对照组相比,高糖组和高糖+胃饥饿素组细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组2种蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论胃饥饿素可促进高糖下的HRMEC增生,抑制高糖诱导的氧化应激和铁死亡。

高糖环境下XIST对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨高糖环境下长链非编码RNA X-非活性特异转录本(XIST)对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法:以人视网膜血管内皮细胞为研究对象,设对照组和高糖组,分析高糖对人视网膜血管内皮细胞XIST表达的影响;设对照组、高糖组、高糖+XIST组、高糖+阴性对照组,分析过表达XIST对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响;设对照组、高糖组、高糖+XIST组、高糖+XIST+pcDNA3.1-Wnt1组、高糖+XIST+pcDNA3.1-CON组,分析XIST通过Wnt1/β-catenin通路对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。结果:(1)高糖组XIST相对表达量较对照组低(P<0.05)。(2)与对照组比,高糖组细胞增殖活力低,而凋亡率、Wnt1和β-catenin水平高(P<0.05);与高糖+阴性对照组比,高糖+XIST组增殖活力高,而凋亡率、Wnt1和β-catenin水平低(P<0.05)。(3)与对照组比,高糖组细胞增殖活力低,而凋亡率高(P<0.05);与高糖组比,高糖+XIST组增殖活力高,而凋亡率低(P<0.05);与高糖+XIST+pcDNA3.1-CON组比,高糖+XIST+pcDNA3.1-Wnt1组增殖活力低,而凋亡率高(P<0.05)。结论:XIST通过负调控Wnt1/β-catenin通路抑制高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞凋亡。

lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)损伤的影响及其可能的作用机制。方法:采用高糖诱导hRMECs建立细胞损伤模型。高糖(HG)组将hRMECs培养在浓度为25 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基24 h;正常(NG)组将hRMECs培养在浓度为5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基;按照实验设计分别将si-NC、si-SNHG6、si-SNHG6和anti-miR-NC、si-SNHG6和anti-miR-186-5p转染至hRMECs,随后25 mmol/L D-葡萄糖孵育24 h,分别记为HG+si-NC组、HG+si-SNHG6组、HG+si-SNHG6+anti-miR-NC组、HG+si-SNHG6+anti-miR-186-5p组。qRT-PCR法检测lncRNA SNHG6、miR-186-5p的表达量;双荧光素酶报告实验检测lncRNA SNHG6与miR-186-5p的靶向关系;MTT法与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10的水平;采用试剂盒检测SOD的活性和MDA的水平;Western blot检测cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果:HG组与NG组比较lncRNA SNHG6表达升高,miR-186-5p表达降低(均P<0.05);lncRNA SNHG6可靶向结合miR-186-5p。转染si-SNHG6后细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax蛋白水平,IL-1β、TNF-α、IL-8含量以及MDA活性降低(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10含量以及SOD的活性升高(P<0.05)。共转染si-SNHG6和anti-miR-186-5p后,细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax、IL-1β、TNF-α、IL-8以及MDA升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10和SOD降低(P<0.05)。结论:干扰lncRNA SNHG6表达可通过促进miR-186-5p表达而抑制高糖诱导的hRMECs凋亡、炎症反应及氧化应激。

玄参提取物对糖尿病视网膜病变微血管内皮细胞损伤的影响及其作用机制

目的:探讨玄参提取物抑制微小RNA-646(miR-646)改善微血管内皮细胞损伤缓解糖尿病视网膜水肿的影响及其作用机制。方法:根据简单随机化法将人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)细胞分为对照组、模型组(30 mmol/L葡萄糖)、观察组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL玄参提取物组)、模型+Anti-NC(转染Anti-NC+30 mmol/L葡萄糖)、模型+Anti-miR-646(转染Anti-miR-646+30 mmol/L葡萄糖)组;将30只小鼠根据简单随机化法分为对照组、模型组(60 mg/kg的链脲佐菌素)、观察组(60 mg/kg的链脲佐菌素+100 mg/kg-的玄参提取物),每组10只。比较各组细胞增殖,迁移及miR-646、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)表达;比较各组小鼠视网膜组织ICAM-1、CD31表达及视网膜组织水肿情况。结果:细胞实验结果显示,与对照组比较,模型组细胞miR-646、ICAM-1表达显著升高,VEGFA、CD31表达显著下降(均P<0.05);与模型组比较,观察组细胞miR-646、ICAM-1表达显著降低,VEGFA、CD31表达显著升高(均P<0.05);与模型+Anti-NC组比较,模型+Anti-miR-646组细胞增殖率、迁移细胞数及VEGFA表达显著增加,miR-646表达及凋亡率显著降低(均P<0.05)。动物实验结果显示,与对照组比较,模型组小鼠视网膜组织中miR-646、ICAM-1表达显著升高,VEGFA、CD31表达显著下降(均P<0.05),同时小鼠视网膜组织水肿情况加重;与模型组比较,观察组小鼠网膜组织中miR-646、ICAM-1表达显著降低,VEGFA、CD31表达显著升高(均P<0.05),同时小鼠视网膜组织水肿明显得到缓解。结论:玄参提取物可能通过miR-646/VEGFA机制调节HRMEC细胞增殖、迁移和凋亡,改善缓解糖尿病视网膜水肿。

连翘苷通过调控CTRP3表达对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响及其机制研究

目的比较不同剂量连翘苷(PHN)对高糖(HG)诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤的影响,并分析其对补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)表达的调控作用及可能的作用机制。方法采用HG培养人视网膜血管内皮细胞并建立细胞损伤模型(HG组)。HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组人视网膜血管内皮细胞分别用1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、100μmol·L^(-1)PHN处理后进行HG诱导。HG+pcDNA组、HG+pcDNA-CTRP3组分别用pcDNA、pcDNA-CTRP3转染至人视网膜血管内皮细胞后进行HG诱导。HG+PHN-H+sh-NC组、HG+PHN-H+sh-CTRP3组分别用sh-NC、sh-CTRP3转染后,用100μmol·L^(-1)PHN处理HG诱导的人视网膜血管内皮细胞。检测细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot分别检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、CTRP3蛋白表达水平。结果与Con组比较,HG组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均升高,SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白、CTRP3 mRNA及蛋白水平均降低(均为P<0.05)。与HG组比较,HG+PHN-L组、HG+PHN-M组、HG+PHN-H组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均降低,且HG+PHN-H组<HG+PHN-M组<HG+PHN-L组(均为P<0.05),SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白、CTRP3 mRNA及蛋白水平均升高,且HG+PHN-H组>HG+PHN-M组>HG+PHN-L组(均为P<0.05)。与HG+pcDNA组比较,HG+pcDNA-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均降低,SOD、GSH-Px、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均升高(均为P<0.05)。与HG+PHN-H+sh-NC组比较,HG+PHN-H+sh-CTRP3组细胞凋亡率、MDA水平、Bax蛋白水平均升高,SOD水平、GSH-Px水平、CTRP3蛋白、Bcl-2蛋白水平均降低(均为P<0.05)。结论PHN可减轻HG诱导的人视网膜血管内皮细胞损伤,其作用机制可能与上调CTRP3表达有关。

二十烷二酸通过结合PPARδ介导ANGPTL4表达增多对人视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 研究二十烷二酸(C20DC)对人视网膜内皮细胞(HREC)增殖、迁移能力的影响,并探讨其作用机制。方法 寻找C20DC干预人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞与HREC的最佳工作浓度,分别为30 mg·L^(-1)与25 mg·L^(-1)。将HREC分为C20DC处理组(C20DC干预HREC)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)干预HREC],通过细胞增殖和迁移实验观察C20DC对HREC迁移及增殖能力的影响;采用分子对接方法模拟C20DC与PPARδ的结合能力;将ARPE-19细胞设为C20DC+ARPE-19组(C20DC干预ARPE-19细胞)与DMSO+ARPE-19组(DMSO干预ARPE-19细胞),采用Western blot检测ARPE-19细胞中PPARδ和血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)蛋白,以及HREC中ANGPTL4蛋白表达水平;采用ELISA定量分析ARPE-19细胞与HREC中ANGPTL4蛋白表达水平。结果 与对照组相比,C20DC处理组细胞增殖、迁移能力均显著提高(均为P<0.05),且可与PPARδ结合稳定(结合能为-7.2 kcal·mol^(-1));Western blot检测结果提示,C20DC+ARPE-19组细胞中ANGPTL4蛋白表达量高于DMSO+ARPE-19组,差异有统计学意义(P<0.05),两组PPARδ受体蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);C20DC处理组细胞中ANGPTL4蛋白表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA定量分析检测结果显示,C20DC+ARPE-19组细胞中ANGPTL4表达量高于DMSO+ARPE-19组(P<0.001);C20DC处理组细胞中ANGPTL4的表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 C20DC可结合PPARδ促进ANGPTL4蛋白的表达,导致视网膜相关细胞(HREC与ARPE-19细胞)增殖与迁移能力增强,其作用机制可能与早产儿视网膜病变新生血管生成增多有关。

鼠视网膜血管内皮细胞体外培养的改良及鉴定

背景视网膜血管内皮细胞（RVECs）的体外培养是进行视网膜血管性疾病研究的基础，人眼球供体的缺乏是限制人血管内皮细胞培养的主要原因，与人高度同源的大鼠血管内皮细胞的培养方法已经建立，但其分离方法对细胞损伤较大，影响细胞的培养效率。目的建立和改良大鼠RVECs的培养方法。方法选取5只SD大鼠眼球，获得视网膜，用组织块培养法，将大鼠视网膜用质量分数0．1％胶原酶消化，并加入质量分数20％胎牛血清、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮细胞生长添加物（ECGS），用血管内皮细胞培养基中和后充分吹打，制备细胞及组织悬液，接种于人纤维粘连蛋白（FN）包被的培养瓶中。用Ⅷ因子相关抗体鉴定培养的内皮细胞。结果组织块法消化培养2d可见细胞从组织块游出，培养4d可伸出触角呈梭形，5～6d可融合生长，培养14d后的细胞呈单层生长，培养的细胞Ⅷ因子相关抗体染色阳性。传代培养的细胞接种2h可重新贴壁，恢复融合生长状态。结论视网膜组织块培养并用胶原酶消化可获得活性较强的细胞和碎片，再用高选择性的血管内皮细胞培养基和FN促贴壁进行选择性培养，可获得纯度较高的RVECs。

基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路探讨柚皮素对视网膜微血管内皮细胞的损伤机制研究

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路探讨柚皮素(NAR)对人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的损伤机制。方法 将HRMECs随机分为对照组、高糖(HG)组、HG+NAR组(3 mg/L NAR)、HG+激活剂(AICAR)组(1 mmol/L AICAR)、HG+NAR+AICAR组(3 mg/L NAR+1 mmol/L AICAR);除对照组向培养基中加入5 mmol/L的D-葡萄糖处理外,其他各组均向培养基中加入30 mmol/L的D-葡萄糖处理。采用CCK-8及Transwell分别检测细胞增殖及迁移情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测自噬因子LC3 mRNA、p62 mRNA表达水平;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测AMPK/mTOR通路及自噬相关蛋白表达水平。结果 与对照组相比,HG组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+NAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,但HG+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+NAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+AICAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NAR可减轻HG诱导的HRMECs损伤,其机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的自噬有关。