神经胶质成熟因子-β诱导糖尿病大鼠视网膜Müller细胞炎症反应的机制研究

目的 研究神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的作用及相关机制。方法SPF级雄性SD大鼠60只,采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55 mg/kg)制备糖尿病模型后分为STZ组、STZ+AAVGMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组大鼠于成模8周后玻璃体腔单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL。STZ+AAV-GMFB+K252a组在注射腺病毒基础上给予腹腔注射25μg/(kg·d)的K252a。12周后,免疫荧光检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测视网膜胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,酶联免疫吸附试验检测视网膜炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的表达,Western blot检测GMFB、脑源性神经营养因子(BDNF)及磷酸化酪氨酸激酶受体B(p-TrkB)蛋白相对表达水平。HE染色检测视网膜病理改变。结果 GMFB在Müller细胞中大量表达。与CON组比较,STZ组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加,BDNF、p-TrkB蛋白表达减少,视网膜神经节细胞(RGC)排列紊乱,数量减少;与STZ组比较,STZ+AAV-GMFB组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,BDNF、p-TrkB蛋白表达增加,RGC排列整齐,数量增加。TrkB抑制剂K252a能大部分逆转AAVGMFB的保护作用。结论 糖尿病大鼠视网膜GMFB表达增加,诱导了Müller细胞活化,加重了炎症反应,该作用与抑制BDNF/TrkB信号通路有关。

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^(-1)(NG)与35 mmol·L^(-1)的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^(-1)的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^(-1)的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共聚焦显微镜观察RFP-GFP-LC3串联质粒转染后各组Müller细胞中自噬通量的变化;TUNEL染色检测各组Müller细胞的凋亡率,Western blotting法检测细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax与cleaved Caspase-3及Wnt/β-catenin途径中β-catenin蛋白的表达。结果:与NG组相比,HG组Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.01);与NG组比较,HG+si-NC组、HG+si-LRP6组Müller细胞中除P62和Bcl-2蛋白表达显著降低外(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体、细胞中自噬通量、TUNEL阳性细胞率及细胞中Bad、cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);而与HG+si-NC组比较,HG+si-LRP6组中除P62、Bcl-2蛋白明显升高外(P<0.05),其他检测指标均显著降低;此外,与NG组比较,HG+si-NC组中β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.05),而HG+si-LRP6组明显降低(P<0.05);其中与HG+si-NC组相比,HG+si-LRP6组中β-catenin蛋白的降低趋势更为显著(P<0.01)。结论:高糖可促进Müller细胞中LRP6的表达,采用siRNA干扰技术沉默细胞中LRP6表达可能通过下调Wnt/β-catenin途径抑制高糖诱导的Müller细胞自噬,并减少细胞的凋亡。

神经胶质成熟因子-β对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能机制

目的 探讨神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能作用机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg-1)的方法制备雄性SD大鼠的糖尿病模型,并按照随机数字表法分成STZ组、STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠于成模8周后玻璃体内单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL;STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠在注射腺病毒基础上给予腹腔注射colivelin(2 mg·kg·d-1),共注射4周;CON组和STZ组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水。成模12周后,免疫荧光染色检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测GFAP的表达,ELISA检测视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量,Western blot检测视网膜中GMFB、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达。结果 GMFB在STZ组Müller细胞中与GS大量共定位。与CON组相比,STZ组大鼠视网膜中GFAP表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列紊乱,数量明显减少;与STZ组相比,STZ+AAV-GMFB组大鼠视网膜中GFAP表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列整齐,数量明显增加。STZ+AAV-GMFB+colivelin组能大部分逆转AAV-GMFB的保护作用。结论 敲减GMFB基因能抑制糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的活化,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的：仿照前人建立的方法，优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法，为后续相关研究建立实验室条件。方法：使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞，以DMEM为培养基体外培养，光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果：培养的细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，细胞质丰富，折光性好。电镜下可见特征性的中间丝（直径8～10nm），细胞器丰富；荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶（GS）阳性。结论：酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。

低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子1α和促红细胞生成素蛋白表达的影响

目的探讨低氧对大鼠视网膜Müller细胞低氧诱导因子(HIF)-1α和促红细胞生成素(EPO)蛋白表达的影响。方法体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞,分为正常对照组(N组)、氯化钴浓度:50,100,150,200,300μmol/L(C50、C100、C150、C200、C300组),MTT检测不同浓度氯化钴对Müller细胞活力的影响。免疫细胞化学、细胞免疫荧光检测、Western印迹和酶联免疫吸附试验检测HIF-1α、EPO蛋白表达的情况。结果氯化钴浓度低于200μmol/L时,细胞活力不受氯化钴浓度的影响。从200μmol/L开始,细胞活力随氯化钴浓度增高而下降。氯化钴浓度高于50μmol/L时,HIF-1α、EPO蛋白免疫染色可见阳性表达。酶联免疫吸附试验检测,从50μmol/L开始HIF-1α蛋白的表达随氯化钴浓度升高而增加。Western印迹检测,EPO蛋白表达从50μmol/L开始增高,在150μmol/L时达到高峰,以后逐渐下降。结论低氧可引起细胞活性改变并诱导视网膜Müller细胞HIF-1α和EPO蛋白表达的变化。

大鼠视网膜Müller细胞在高糖、氧化应激、缺氧中的表现

目的观察Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞在高糖、氧化应激、缺氧三种病理环境下的特征,为糖尿病视网膜病变的防治提供新的研究依据。方法体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞,并用谷氨酰胺合成酶(GS)鉴定。将传2代的细胞随机分为四组:对照组、高糖组、氧化应激组、缺氧组。倒置显微镜观察细胞形态学改变,免疫荧光染色法观察细胞GS和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化,Transwell小室观察细胞迁移能力。结果体外成功培养并鉴定鼠Müller细胞,四组Müller细胞功能均受损,氧化应激组以及缺氧组结构受损明显,失去正常形态。缺氧组中α-SMA的表达呈阳性,并且在Transwell小室中发生迁移的细胞数明显多于其他组,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论高糖、氧化应激、缺氧均可导致Müller细胞功能受损,缺氧可诱导Müller细胞转化为具有迁移能力的肌纤维样细胞,提示Müller细胞参与了增生性糖尿病视网膜病变的发病过程。

大鼠视网膜Müller细胞体外培养特性

目的探讨视网膜Müller细胞(RMCs)体外培养方法,研究其增殖、凋亡特性。方法将出生7 d的SD大乳鼠处死,分离出视网膜组织并收集于培养皿中,分别加入木瓜蛋白酶(27 U/ml)和0. 25%的胰蛋白酶37℃进行消化30 min,使用20%FBS的DMEM/F12培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打,接种于6孔培养板,放入37℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养。定时观察细胞的生长情况,2～3 d换液1次。当细胞长满培养板的80%～90%时进行消化终止,按1:3传代,移入放有细胞爬片的6孔培养板,置于5%CO2恒温培养箱中培养。在倒置显微镜下观察细胞形态变化。在原代培养5 d时,将细胞爬片取出,进行谷氨酰胺合成酶(GS)、波型蛋白(Vimentin)免疫荧光染色。结果原代培养的RMCs与神经元细胞共同生长,随接种时间延长,逐渐自接种块周边爬行生长,呈扁平的多边形融合状生长,并有较长的突起,传2代时细胞纯化率高,传3～4代时细胞失去原有秩序,体积约有原代的3～4倍,胞质内见明显束状纤维增生。GS主要在Müller细胞胞核和胞质中表达,胞膜不表达,其阳性表达率达80%以上。Vimentin主要在Müller细胞胞质中表达,其阳性表达率达90%以上。结论本试验通过酶分步消化法以及机械吹打法在体外成功培养并纯化了视网膜Müller细胞,GS和Vimentin均可鉴别视网膜Müller细胞,将二者一起使用可提高Müller细胞鉴别率;随着体外传代培养时间延长,Müller细胞逐渐分化为带有收缩功能的纤维细胞,这可能参与了增生性视网膜病变的发病机制。

糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的超微结构变化

目的研究糖尿病大鼠视网膜Müller细胞超微结构变化特点及其在糖尿病视网膜病变的作用。方法应用透射电镜技术系统观察糖尿病大鼠4w、8w、12w和24w视网膜病理改变,特别是视网膜Müller细胞形态变化特点。结果视网膜Müller细胞从4w开始出现少量线粒体肿胀,嵴溶解,并随糖尿病的病程逐渐加重,线粒体肿胀、嵴断裂、空泡状明显。各时段均未发现典型的毛细血管闭锁、管腔狭窄等改变,血管内皮细胞、周细胞基本正常。结论糖尿病视网膜Müller细胞的超微结构改变要早于视网膜血管内皮细胞及周细胞超微结构的改变,在神经节细胞层及神经纤维层改变最明显,并随糖尿病时间的延长Müller细胞形态结构改变更加明显。

牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的探讨牛磺酸对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜Müller细胞的影响及机制。方法取雄性SD大鼠随机分为对照组、DM组、牛磺酸组、PBS组(n=6/组),对照组正常大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液,DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导的DM模型,牛磺酸组DM大鼠腹腔注射牛磺酸,PBS组DM大鼠腹腔注射PBS。3个月后试剂盒检测视网膜还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hor-mone,GSH)及含量丙二醛(malondialdehyde,MDA),Western blot检测视网膜胶质纤维酸性蛋白(glial fi-brillary acidic protein,GFAP)及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达。结果对照组MDA及GSH含量分别为(3.52±0.51)nmol/mg prot及(95.47±8.73)mg/g prot;DM组及PBS组MDA含量分别为(6.72±0.75)、(7.22±0.54)nmol/mg prot,较对照组明显增高(P<0.05),而GSH含量分别为(46.38±5.31)、(63.21±6.48)mg/g prot,较对照组明显降低(P<0.05);牛磺酸组MDA及GSH含量分别为(4.01±0.38)nmol/mg prot、(85.39±8.47)mg/g prot较对照组,差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,DM及PBS组视网膜GFAP表达上调,GS表达下调,牛磺酸组GFAP及GS表达无明显变化。结论抑制DM视网膜氧化应激是牛磺酸保护Müller细胞,上调GS表达的重要机制之一。

重组人促红细胞生成素对高糖培养大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的探讨重组人促红细胞生成素对高浓度葡萄糖培养大鼠视网膜Müller细胞功能的影响。方法体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞,分组为N组(正常对照),G25组(25 mmol/L葡萄糖),G50组(50 mmol/L葡萄糖),EG25组(4×104IU/L rh EPO+25 mmol/L葡萄糖),EG50组(4×104IU/L rh EPO+50 mmol/L葡萄糖),MTT检测各组细胞活性。细胞免疫染色、ELISA检测各组细胞GS蛋白表达的情况。结果 MTT检测示N组细胞活性高于G25组、G50组、EG25组和EG50组,EG25组高于G25组,EG50组高于G50组。细胞免疫荧光染色检测各组细胞均有GS蛋白阳性着染。酶联免疫吸附试验检测N组GS蛋白表达高于各高浓度葡萄糖培养组,EG25组、EG50组蛋白表达分别高于G25组和G50组。结论重组人促红细胞生成素可增加高浓度葡萄糖培养大鼠视网膜Müller细胞活性并上调GS蛋白的表达。

高浓度葡萄糖体外对大鼠视网膜Müller细胞活性的影响及其机制探讨

目的观察高浓度葡萄糖对体外培养大鼠视网膜Müller细胞活性的影响,探讨其作用机制。方法体外传代培养大鼠视网膜Müller细胞,随机分为N、G15、G25、G35组,分别给予DMEM培养基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基培养5 d。采用MTT法检测各组细胞光密度值(OD值,代表细胞活性),采用细胞免疫化学染色、免疫荧光(FITC标记)染色及酶联免疫吸附试验检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)和促红细胞生成素(EPO)蛋白。结果 N、G15、G25、G35组细胞OD值分别为0.83±0.02、0.55±0.02、0.45±0.02、0.33±0.02,组间比较,P均<0.01。N组未见HIF-1α、EPO阳性细胞,G15、G25、G35组可见黄染的HIF-1α阳性细胞及呈绿色荧光的EPO阳性细胞。N、G15、G25、G35组HIF-1α蛋白OD值分别为0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92±0.02,组间比较,P均<0.01;EPO蛋白OD值分别为0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25±0.02,组间比较,P均<0.01。结论高浓度葡萄糖可降低体外培养大鼠视网膜Müller细胞活性,促进细胞HIF-1α、EPO蛋白表达可能是其作用机制之一。

姜黄素对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的探讨姜黄素对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的影响及作用机制。方法雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型,实验分4组(每组各6只):对照组(SD大鼠腹腔单次注射柠檬酸缓冲液)、DM组(链脲佐菌素诱导的DM大鼠)、DMSO组(DM大鼠腹腔注射二甲基亚砜及生理盐水混合液,每天一次)、姜黄素组(DM大鼠腹腔注射姜黄素80mg·kg(-1),每天一次)。3个月后检测视网膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)及还原型谷胱甘肽(reduced gluta-thione hormone,GSH)含量,视网膜胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫组织化学染色,Western-blot检测视网膜GFAP及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达变化,高效液相色谱检测视网膜谷氨酸含量。结果对照组MDA、谷氨酸、GSH分别为(3.47±0.51)nmol·mg(-1)prot、(35.6±4.8)nmol·mg(-1)、(98.61±9.82)mg·g(-1)prot,DM组分别为(7.21±0.83)nmol·mg(-1)prot、(49.4±4.1)nmol·mg(-1)、(54.86±3.47)mg·g(-1)prot,DMSO组分别为(7.13±0.74)nmol·mg(-1)prot、(52.5±3.7)nmol·mg(-1)、(59.61±5.38)mg·g(-1)prot;DM组及DMSO组MDA及谷氨酸含量较对照组明显增加,GSH含量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);姜黄素组MDA、GSH及谷氨酸含量分别为(3.91±0.43)nmol·mg(-1)prot、(86.93±7.84)mg·g(-1)prot、(38.4±3.7)nmol·mg(-1),与对照组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05),而与DM组相比,姜黄素组MDA含量、谷氨酸含量均降低(均为P<0.05),GSH含量增加(P<0.05)。Western-blot检测结果显示,DM及DMSO组视网膜GFAP表达上调,GS表达下调,姜黄素组GFAP及GS表达均无明显变化。免疫组织化学染色结果显示,对照组视网膜Müller细胞未见明显GFAP阳性染色,DM组及DMSO组Müller细胞胞体及突起呈明显GFAP阳性,但姜黄素组Müller细胞GFAP阳性染色明显弱于DM组。结论姜黄素可上调DM早期大鼠视网膜GS表达,清除视网膜谷氨酸,保护Müller细胞,其机制可能与姜黄素抑制DM视网膜氧化应激有关。

艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用

目的:研究艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞(RMCs)增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将培养的RMCs分为正常对照组、甘露醇对照组、模型组、罗格列酮阳性对照组及艳山姜挥发油高(1μg/L)、中(0.5μg/L)、低(0.25μg/L)浓度组。给药48 h后,MTT法检测艳山姜挥发油对高糖诱导RMCs增殖的影响,苏木素-伊红染色(HE)进行形态学观察,划痕修复实验及transwell实验分别分析RMCs迁移能力和侵袭能力。免疫印迹法(Western blot)分析血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:高糖作用后,RMCs增殖率、迁移及侵袭能力显著升高(P<0.01);VEGF蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,给予艳山姜挥发油及罗格列酮预保护能显著抑制RMCs的异常增殖(P<0.05),RMCs形态和数量趋近正常对照组,RMCs迁移和侵袭能力显著降低,同时显著下调了VEGF蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:艳山姜挥发油对高糖诱导下RMCs的增殖及VEGF蛋白的表达具有调控作用。

红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡

背景:有研究发现红景天苷对糖尿病视网膜病变有改善作用,但红景天苷对高糖引起视网膜Müller细胞损伤的保护作用尚不明确。目的:探讨红景天苷对高糖诱导的大鼠视网膜Müller细胞系(rMC-1)氧化应激及细胞凋亡的保护作用及其作用机制。方法:高糖培养rMC-1细胞模拟高糖环境,实验分为4组:正常对照组;高糖损伤组(培养基葡萄糖终浓度为35.5 mmol/L);红景天苷组(加入红景天苷处理4 h,再加入高糖共同孵育);PI3K抑制剂组(红景天苷和PI3K抑制剂共同处理4 h,再加入高糖共同孵育)。48 h后使用CCK8法检测各组细胞活力,DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平,采用试剂盒测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,采用Western blot检测PI3K、AKT、磷酸化AKT(P-AKT)、Cleaved caspase-3蛋白表达的变化。结果与结论:①与正常对照组相比,高糖损伤组细胞活力、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力显著降低,活性氧水平、细胞凋亡率明显增高,Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著增加,而P-Akt/Akt蛋白表达比值降低(均为P<0.05);②与高糖损伤组比较,红景天苷组细胞存活率、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力明显升高,活性氧水平、细胞凋亡率显著降低,Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著下降,P-Akt/Akt蛋白表达比值增加(P<0.05);③PI3K抑制剂组各指标与高糖损伤组无显著差异(P>0.05);④结果说明,红景天苷能通过激活PI3K/Akt通路抑制高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡,减轻rMC-1细胞损伤。

两种大鼠视网膜Müller细胞培养方法比较

目的比较酶消化法与组织块法培养大鼠视网膜Müller细胞的效果。方法将新生3d的SD大鼠视网膜分离为小组织块,分别采用酶消化法与组织块法进行体外培养,采用换液时机械震荡等方法获得纯化的Müller细胞。从细胞形态学、细胞增殖及免疫细胞化学染色阳性率方面比较两种细胞培养方法的效果。结果酶消化法获得的Müller细胞数量多于组织块法(t=2.264,P<0.05),且用时短。两种方法培养的纯化Müller细胞增殖速度及免疫细胞化学染色阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)。结论酶消化法是一种高效的大鼠视网膜Müller细胞培养方法。

叔丁基对苯二酚对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞的抗氧化应激作用及其机制

目的研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)对高糖环境下SD大鼠视网膜Müller细胞氧化应激的影响及其机制。方法体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞。将实验分为正常对照组、高糖组和tBHQ干预组,采用Western blot法和实时荧光定量PCR测定各组Müller细胞核因子-E2相关因子(Nrf2)、血红素氧化酶1(HO-1)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及其mRNA的相对表达量。结果体外培养Müller细胞的细胞体扁平不规则,细胞核呈卵圆形,细胞质丰富,相邻细胞交织形成网状;Western blot法检测结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF的蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=73.831、148.618、152.269、91.217,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量分别是0.17±0.02、0.47±0.02、0.67±0.07和0.60±0.05,较正常对照组的0.06±0.01、0.19±0.03、0.06±0.00和0.07±0.02明显增加,差异均有统计学意义(t=4.114、9.275、16.479、13.353,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1蛋白表达量分别为0.40±0.06、0.72±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=7.847、7.947,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF蛋白表达量分别为0.18±0.04、0.26±0.07,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=13.215、8.444,均P=0.000)。实时荧光定量PCR测定结果显示,正常对照组、高糖组和tBHQ干预组Müller细胞中Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=340.317、1582.911、488.852、185.699,均P<0.001);其中高糖组Nrf2、HO-1、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量分别是1.53±0.06、1.50±0.04、2.56±0.09和3.04±0.19,较正常对照组的1.07±0.07、0.95±0.05、0.99±0.02和1.09±0.08明显增加,差异均有统计学意义(t=7.292、15.014、30.550、18.573,均P<0.001);tBHQ干预组Nrf2、HO-1mRNA相对表达量分别为2.68±0.09、2.94±0.05,较高糖组增加,差异均有统计学意义(t=18.046、39.458,均P<0.001);tBHQ干预组HIF-1α、VEGF mRNA相对表达量分别为1.48±0.05、1.6±0.08,较高糖组降低,但较正常对照组增加,差异均有统计学意义(t=21.036、13.739,均P<0.001)。结论tBHQ通过激活抗氧化应激Nrf2/ARE信号通路,对高糖环境下Müller细胞损伤起保护作用。

抑制JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及对谷氨酸转运蛋白表达的影响

目的探讨JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞及对谷氨酸转运蛋白(glutamate transporter,GLAST)表达的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分成对照组、糖尿病组、AG490组,每组10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 50 mg·kg^(-1)诱导糖尿病模型。模型诱导成功后,AG490组给予AG490 10μL(17 mmol·L^(-1))玻璃体内注射给药。注射1个月后,利用试剂盒检测3组大鼠视网膜中谷氨酸含量变化,免疫荧光检测视网膜GLAST表达,免疫组织化学检测视网膜p-JAK2表达,Western blot检测视网膜GLAST、p-JAK2及p-STAT3蛋白相对表达量。结果与对照组GLAST相对表达量(65. 35±0. 66)%、p-JAK2相对表达量(32. 80±0. 40)%、p-STAT3相对表达量(17. 62±1.09)%、谷氨酸含量(23. 93±0. 67)μmol·g^(-1)相比,糖尿病组视网膜p-JAK2相对表达量(52. 16±0. 62)%、p-STAT3相对表达量(47. 41±0. 95)%及谷氨酸含量(44. 88±0. 27)μmol·g^(-1)均明显增加,GLAST相对表达量(32. 96±0. 64)%明显下降(均为P <0. 01);而与糖尿病组相比,AG490组p-JAK2相对表达量(13. 67±0. 45)%、p-STAT3相对表达量(14. 47±0. 25)%及谷氨酸含量(25. 18±0. 66)μmol·g^(-1)均明显降低,GLAST相对表达量(49. 48±0. 32)%明显增加(均为P <0. 01)。结论糖尿病早期大鼠视网膜GLAST表达明显降低,抑制JAK/STAT通路的活化可上调视网膜GLAST表达,降低视网膜谷氨酸含量,这可能有助于减轻糖尿病状态下视网膜Müller细胞的损伤。

CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的抑制作用

目的探讨CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分成对照组、糖尿病组、治疗组(CDK抑制剂SCH727965),每组各10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射55 mg·kg^-1链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法诱导糖尿病模型。模型诱导成功后,治疗组玻璃体内注射SCH727965 8μL(3 nmol·L^-1)。12周后,免疫荧光检测三组大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,免疫组织化学检测视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)表达,Western blot检测GFAP、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PEDF蛋白相对表达量。结果与对照组GFAP (100.00±0.00)%、VEGF(100.00±0.00)%、PEDF(38.26±0.52)%、PCNA(9.34±0.47)%表达相比,糖尿病组GFAP(168.24±2.72)%、VEGF(156.79±1.75)%、PCNA(16.11±0.34)%表达均明显增加,PEDF(23.72±0.71)%表达明显降低(均为P<0.01);而与糖尿病组相比,治疗组GFAP(124.37±3.01)%、VEGF(118.36±1.98)%、PCNA(12.05±0.67)%表达均明显降低,PEDF(8.22±0.36)%表达明显增加(均为P<0.05)。结论 SCH727965可下调大鼠糖尿病状态下视网膜GFAP、VEGF、PCNA表达,上调PEDF表达,进而抑制Müller细胞增殖及新生血管形成。

脑源性神经营养因子对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的探讨脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用。方法健康雄性SD大鼠54只,腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。随机分为对照组、糖尿病组、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)组。含0.1 g·L^(-1)BSA的PBS平衡盐溶液制备BDNF注射液。BDNF组大鼠于糖尿病模型建成4周后开始注射BDNF注射液,对照组和糖尿病组注射等剂量的PBS平衡盐溶液。8周后,利用免疫荧光及Western blot检测胶质细胞谷氨酸转运体(L-glutamate/L-aspartate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)及神经元标记物SYN(synaptophysin)的表达量,谷氨酸含量测定试剂盒检测视网膜中谷氨酸的含量。结果与对照组相比,糖尿病组GLAST、GS、SYN表达显著下降,且视网膜谷氨酸含量均明显升高(均为P<0.01),而BDNF组差异均无统计学意义(均为P>0.05);与糖尿病组相比,BDNF组GLAST、GS、SYN表达均升高(均为P<0.01),谷氨酸含量均显著减少(均为P<0.01)。结论糖尿病视网膜病变早期给予外源性BDNF可以提高Müller细胞中GLAST、SYN及GS表达活性,改善Müller细胞功能,并且能使视网膜神经节细胞免受损害,提示BDNF对糖尿病视网膜病变条件下视网膜中的Müller细胞具有保护作用。

葛花总黄酮对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的探讨葛花总黄酮(total flavonoids of pueraria,TFP)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用。方法取SPF级雄性SD大鼠60只,采用单次腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg-1)制作大鼠糖尿病模型。将造模成功的糖尿病大鼠随机分成糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组(Brusatol为核因子NF-E2相关因子信号通路抑制剂),每组15只。另取15只正常大鼠作为对照组。造模12周后,检测各组大鼠血糖浓度、体质量、视网膜谷氨酸含量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量;采用免疫组织化学法检测视网膜神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,免疫荧光染色检测大鼠视网膜Nrf2表达,Western blot检测大鼠视网膜Nrf2、血红素氧合酶-1(HO-1)及谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达。结果造模12周后,糖尿病组大鼠血糖浓度高于对照组,且均大于16.7 mmol·L^-1;TFP组及TFP+Brusatol组血糖浓度均低于糖尿病组(均为P<0.05);糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组大鼠体质量均低于对照组(均为P<0.05)。糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜谷氨酸含量高于对照组(均为P<0.05);TFP组谷氨酸含量低于糖尿病组(P<0.05)。糖尿病组和TFP+Brusatol组MDA含量均高于对照组,SOD活性均低于对照组(均为P<0.05)。TFP组MDA含量低于糖尿病组,SOD活性高于糖尿病组(P<0.05)。糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜GFAP蛋白表达阳性率均高于对照组(均为P<0.05);TFP组GFAP蛋白表达阳性率低于糖尿病组(P<0.05)。将对照组Nrf2蛋白免疫荧光强度设定为100.00%,糖尿病组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于对照组(P<0.05)。TFP组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于糖尿病组(P<0.05),而TFP+Brusatol组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达高于对照组,糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜HO-1和GS蛋白表达均低于对照组(均为P<0.05)。TFP组大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表达均高于糖尿病组(均为P<0.05),而TFP+Brusatol组与对照组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论TFP可通过降低血糖浓度,增强大鼠视网膜的抗氧化能力,进而保护糖尿病状态下受损的Müller细胞,其机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。