补骨脂素可能参与诱导大鼠间充质干细胞向雄性生殖细胞方向分化

目的验证补骨脂素能诱导大鼠间充质干细胞向雄性生殖细胞方向分化的假说。方法使用终浓度为3.0μg/ml的补骨脂素干预大鼠间充质干细胞,显微观察细胞形态变化情况,接着使用MTT法检测细胞增殖变化,最后使用实时荧光定量PCR(Qpcr)测定被干预细胞的七种代表性的生殖分化标记基因的表达变化,七种标记基因分别为:Oct-4、Stra8、RVLG、SCP3、TNP2、Itgb1、Itga6。结果显微观察表明3.0μg/ml的补骨脂素干预72 h后,大鼠间充质干细胞形态变化不显著;MTT法检测表明3.0μg/ml的补骨脂素干预的5 d中,大鼠间充质干细胞增殖情况变化不显著(P>0.05);Qpcr测定表明3.0μg/ml的补骨脂素干预72 h后,显著上调了Oct-4、Stra8、SCP3、Itgb1等基因的表达(P<0.05),而对RVLG、TNP2、Itga6等基因的表达影响不显著(P>0.05)。结论补骨脂素可能参与诱导大鼠间充质干细胞向雄性生殖细胞方向的分化。

炎症微环境对大鼠间充质干细胞增殖及Sirt6表达水平的影响

目的:分析沉默信息调控因子6(silent information regulator 6,Sirt6)在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中的表达情况,以及炎症微环境对其表达水平的影响,为研究Sirt6在牙周炎症条件下骨形成中的作用提供理论依据。方法:根据实验分为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导组、对照组和LPS过表达Sirt6组。经10μg/mL LPS刺激6、12、24、48、72 h,建立细胞的炎症微环境;CCK-8法检测细胞的增殖水平;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光技术检测Sirt6的分布情况;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、蛋白质印迹法(western blot)检测Sirt6在大鼠BMSCs中信使RNA(mRNA)及蛋白的表达水平。结果:10μg/mL LPS刺激BMSCs后,成功建立炎症微环境;与对照组相比较,CCK-8法检测到炎症微环境中BMSCs的增殖速率由增高逐渐趋于下降,炎症因子抑制了BMSCs的增殖速率(P<0.05),而过表达Sirt6则升高BMSCs的增殖速率(P<0.05);ELISA结果显示,随着时间的推移,炎症微环境中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量逐渐下降(P<0.05),表明BMSCs对炎性因子具有调控作用;炎症微环境中,免疫荧光染色显示Sirt6的表达未受到明显抑制;RT-PCR结果显示,LPS过表达Sirt6组中,Sirt6的mRNA表达水平显著升高,且在不同时间点内Sirt6的mRNA表达水平呈现显著性升高;Western blot结果显示,同一时间点LPS诱导组中Sirt6蛋白的表达均出现下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而且随着时间的推移,Sirt6的蛋白表达并没有出现显著性下降,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:炎症因子可以通过抑制Sirt6蛋白的表达影响BMSCs的增殖作用,BMSCs中Sirt6也具有调控炎症因子的作用。

中药诱导大鼠间充质干细胞向神经干细胞分化研究

目的筛选具有诱导大鼠自体骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的有效中药成分。方法用分别含有黄芩苷、三七总皂角苷、红景天苷和察丹酚酸B的诱导培养基对经培养传代的大鼠间充质干细胞进行诱导培养,并设对照组,再将以上4种中药单体诱导的间充质干细胞和对照组细胞用抗神经元特异烯化酶(NSE)抗体、抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和抗Nestin抗体进行免疫组化鉴定,以明确大鼠间充质细胞经这4种中药单体诱导后生长的细胞的性质。结果 4种中药单体诱导的间充质干细胞都表达NSE、GFAP和Nestin,这些细胞形态均表现出具有丰富的胞体和明显的突起,对照组则为胞体较小、呈圆形或椭圆形,突起少且短,甚至没有突起的细胞。结论三七总皂苷、红景天苷、黄芩苷和察丹酚酸B具有诱导间充质干细胞向神经细胞分化的作用。

资冲颗粒对大鼠间充质干细胞生殖分化相关标记基因表达的影响

目的探讨资冲颗粒(熟地、菟丝子等)诱导大鼠间充质干细胞向生殖细胞分化相关基因表达的影响。方法制备大鼠含资冲颗粒血清及大鼠空白血清对大鼠间充质干细胞进行干预。显微镜观察细胞形态变化情况;实时荧光定量PCR测定干预后细胞内生殖分化相关Oct4、Stra8、Itga6、Itgb1、Scp3、Gdf9、Zp1、Zp3基因的表达;MTT法检测细胞增殖情况;运用统计软件分析两组数据。结果镜下观察72 h干预未发现含药血清和空白血清对细胞形态有明显影响;实时荧光定量PCR测定表明含药血清对Stra8、Scp3、Gdf9基因表达有显著影响(P<0.05),对其它基因表达的影响则不显著(P>0.05);MTT法显示5 d干预两组细胞增殖无差别(P>0.05)。结论资冲颗粒大鼠含药血清具有诱导大鼠间充质干细胞向生殖细胞方向分化的潜力。

骨髓骨片法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞和PKH26标记

目的 旨在建立一种高效的方法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,并应用PKH26进行体外标记,探讨PKH26标记对BMSCs生物学特性的影响,以及体外示踪情况。方法 将大鼠5 d乳鼠双后肢骨进行分离,去除周围的肌肉和筋膜,并将其剪成小块进行培养,利用换液、传代提纯BMSCs,应用流式细胞仪测定第3代细胞表面抗原。在培养条件相同的情况下,取第3代BMSCs应用PKH26进行标记,标记组与未标记组在荧光显微镜下对细胞形态学、增殖状态进行观察,比较标记组与未标记组成骨成脂诱导特点及鉴定。结果 骨髓骨片法分离乳鼠双后肢骨,培养BMSCs呈细长梭形,形态均一,短时间内可迅速获得大量BMSCs;经流式细胞仪鉴定结果表明,表达CD29为(91.18±1.29)%,表达CD90为(95.04±0.11)%,表达CD45为(1.74±0.36)%;PHK26标记对BMSCs细胞形态,增殖无明显影响(P>0.05),对成骨成脂诱导无影响。结论 采用大鼠5 d乳鼠骨髓骨片法能够快速培养出大量高纯度的BMSCs,该细胞可作为种子细胞用于骨组织工程;PKH26可对体外大鼠BMSCs进行标记。

白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用研究

目的:探索白藜芦醇(Res)在体外对氧化应激状态下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的保护作用。方法:使用200μmol/L双氧水处理大鼠BMSCs,使其进入氧化应激状态,采用CCK-8、活性氧(ROS)荧光探针、实时荧光定量PCR、Western blot和碱性磷酸酶(ALP)染色等方法分别检测不同浓度的Res对大鼠BMSCs细胞活力、细胞内ROS水平、成骨分化和铁死亡的影响。结果:Res在1~25μmol/L浓度范围内对氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞活力有促进作用(P<0.05)。10μmol/L Res显著降低氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞内ROS水平,增加核红细胞相关因子2(NRF2)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶1(SOD-1)和超氧化物歧化酶2(SOD-2)等抗氧化相关基因的表达(P<0.05)。10μmol/L Res促进氧化应激状态下的大鼠BMSCs成骨相关标志物的表达(P<0.05),明显增强其ALP染色,促进铁死亡相关标志物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)和胱氨酸转运蛋白(XCT)的表达(P<0.05),降低脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和铁蛋白自噬核受体共激活因子4(NCOA4)的表达(P<0.05)。结论:Res能够降低氧化应激诱导的大鼠BMSCs细胞内活性氧和铁死亡水平,并促进氧化应激状态下大鼠BMSCs成骨分化,维持氧化应激状态下的大鼠BMSCs细胞活性。

Pdx-1、Ngn3联合MafA诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞移植治疗1型糖尿病大鼠的效果

目的通过胰十二指肠同源盒1(Pdx-1)、神经元素3(Ngn3)联合V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)共转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs),移植治疗1型糖尿病大鼠并观察其疗效。方法Pdx-1、Ngn3和MafA共转染BMSCs诱导为IPCs,链脲佐菌素(STZ)制备45只1型糖尿病SD大鼠模型,BMSCs组(15只)肾被膜下移植2×10^(6) BMSCs,IPCs组(15只)大鼠肾被膜下移植2×10^(6) IPCs,sham-operation组(15只)大鼠肾被膜下注入等量生理盐水,另取15只健康SD大鼠肾被膜下注入等量生理盐水作为normal组。监测各组大鼠移植第0、7、14、21、28 d空腹血糖及体重;第21天对各组大鼠均行葡萄糖耐量试验;第28天取各组大鼠肾脏组织进行免疫组化。结果BMSCs和IPCs组大鼠血糖随时间下降,移植第21天两组大鼠空腹血糖低于移植第0天,且均低于同期sham-operation组(P<0.05),移植第28天IPCs组大鼠空腹血糖低于BMSCs组(P<0.05)。糖尿病大鼠中IPCs组和BMSCs组腹腔葡萄糖耐量实验曲线下面积小于sham-operation组,且IPCs组曲线下面积最小(P<0.05)。BMSCs组和IPCs组大鼠肾脏组织可见棕色荧光的胰岛素表达,且IPCs组胰岛素荧光光密度高于BMSCs组(P<0.05)。结论Pdx-1-Ngn3联合MafA诱导BMSCs形成的IPCs移植后在糖尿病大鼠体内可降低糖尿病大鼠的空腹血糖。

黄芩苷通过Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的研究黄芩苷（baicalin）对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,rBMSC）成骨分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法采用贴壁筛选法体外培养rBMSC,给予黄芩苷3、5、7d后,比较药物处理组与对照组之间碱性磷酸酶（ALP）的活性.同时检测给予黄芩苷对碱性磷酸酶阳性克隆和矿化结节形成的影响.提取总mRNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR检测黄芩苷对Wnt10a、GSK-3β、β-catenin以及LEF1mRNA水平的影响.免疫印迹检测药物处理对β-catenin以及Runx2蛋白表达量的影响.结果黄芩苷明显提高ALP的活性.10μmol·L-1浓度的黄芩苷还可增加碱性磷酸酶克隆数和钙化结节的形成.黄芩苷还可提高Wnt10a、β-catenin、GSK-3β、LEF1以及osteocalcin的mRNA水平,并提高β-catenin和Runx2的蛋白表达量.结论黄芩苷在0.1～50μmol·L^-1的给药浓度下可促进rBMSC的成骨分化成熟,Wnt/β-cate-nin信号可能参与调控rBMSC的成骨分化.

力学刺激和成骨化学诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的探讨力学刺激与成骨化学诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cellsr,BMSCs)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)I、型胶原(collagen type I,COL I)和骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达与钙化结节形成的影响。方法体外分离培养rBMSCs,分别在成骨诱导和非成骨诱导条件下应用双轴力学应变加载系统对rBMSCs施加周期性的机械张应变(应变2%,频率1 Hz,每次2 h,间隔2 h,每天加载3次)。力学刺激作用3 d和6 d,采用实时荧光定量RT-PCR检测ALP、COL I和OCN的mRNA表达,同时采用茜素红染色法观察钙化结节的形成情况。结果力学刺激作用后,成骨诱导6 d组出现明显的钙化结节,其余各组均无明显钙化结节形成。与相应非诱导组比较,成骨诱导3 d组ALP、COL I和OCN的mRNA表达量分别增加0.63、和11.8倍;成骨诱导6 d组ALP、COL I和OCN的mRNA表达量分别增加2.73、.2和10倍。结论成骨化学诱导剂和力学刺激均能促进rBMSCs的骨向分化,且二者之间具有协同作用。

缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及葡萄糖摄取和Akt表达的影响

目的探讨缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)糖摄取、凋亡、增殖和Akt表达的影响。方法将接种的P3细胞置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育不同时间点(常氧、缺氧0.5、1、2、4和8h)后分别取出,应用放射同位素法检测MSCs对氚标记-葡萄糖(3H-G)的摄取,应用Annexin V/PI双染法进行流式细胞仪(FCM)分析MSCs凋亡率(apoptotic rate,AR)和死亡率(dead rate,DR),应用MTT分析细胞增殖状态以及检测Akt蛋白表达。结果培养的P3骨髓单个核细胞CD29+、CD71+、CD44+、CD34-和5-aza诱导后表达TnT及骨诱导分化液诱导后细胞ALP+等证实其为骨髓MSCs;各缺氧时间点3H-G摄取量较缺氧前均显著性降低(P<0.01),而各缺氧时间点之间没有统计学意义(P>0.05);MSCs常氧、缺氧0.5、1、2、4、6和8h时的AR均较缺氧前显著增高(P<0.01)、DR亦显著增高(P<0.05),不过,随着缺氧时间延伸,AR显著增加(P<0.05),而DR没有统计学意义(P>0.05);缺氧不同时间点MTT法OD值较常氧(缺氧结束同步时间点)均显著性降低(P<0.01),并随缺氧时间延伸显著降低(P<0.05),不过,与常氧(缺氧8h开始同步时间点)相比,均显著升高(P<0.05);与常氧相比,各缺氧时间点Akt蛋白IOD均显著增强(P<0.05),而各缺氧时间点改变无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧既可引起MSCs摄糖量下降、增殖滞缓,又可上调Akt蛋白表达和促进MSCs凋亡。

缺氧环境下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白和mRNA的表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在缺氧环境下凋亡相关蛋白和mRNA的表达。方法将接种的P3细胞置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育,分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h取出分别应用Annexin V/PI双染法进行流式细胞仪(FCM)分析MSCs凋亡率(Apoptotic Rate,AR),并同步用免疫细胞化学、western blotting和Rt-PCR等方法检测Bax/Bcl-2,Fas/Fas L和Caspase-3蛋白和mRNA的表达。结果1.缺氧前,免疫细胞化学法未检测到Bcl-2、Bax、Fas、Fas L和Caspase-3蛋白表达,缺氧0.5h后均可较强表达;2.各缺氧时间点Bcl-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3蛋白和mRNA表达较缺氧前均显著性增高(P均<0.05);随缺氧时间延伸,Bcl-2蛋白和mRNA表达不显著增加(P>0.05),而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3蛋白和mRNA表达均显著增加(P均<0.05),但缺氧6-12h时间点之间表达均没有统计学意义(P均>0.05);3.AR和Bcl-2/Bax蛋白(r1=-0.417,P=0.043)及mRNA(r2=-0.435,P=0.040)呈显著负相关,而和Fas(r1=0.639,P=0.025;r2=0.711,P=0.018)、Fas-L(r1=0.581,P=0.022;r2=0.605,P=0.037)、Caspase-3(r1=0.704,P=0.014;r2=0.657,P=0.026)蛋白及mRNA均呈显著正相关。结论在缺氧促进MSCs凋亡的过程中,Bcl-2蛋白和mRNA可能起着保护作用,而Bax、Fas-L、Fas、Caspase-3蛋白和mRNA可能在MSCs凋亡的进程中起着促进作用。

骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞倍增反应和分化的作用机制实验

背景骨碎补总黄酮(total flavonoids of rhizome drynariae,TFRD)是骨碎补的主要活性成分,近年来许多研究表明TFRD可有效提高骨质疏松症患者骨密度,进而促进骨愈合,但目前其作用的具体分子机制尚不完全明确。目的探讨TFRD对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)倍增反应和分化作用的分子机制。方法获取SD大鼠的骨髓间充质干细胞。细胞培养基中加入TFRD,根据TFRD浓度的不同分为低浓度组(TFRD 0.1 mg/L)、中浓度组(TFRD 1.0 mg/L)、高浓度组(TFRD 10.0 mg/L),细胞培养基中未加入TFRD的作为对照组。采用CCK8法检测各组BMSCs细胞增殖情况,茜素红染色法检测各组成骨分化情况,RT-PCR法和Western blot法检测中浓度组与对照组β-catenin、RunX2、PPARG的mRNA和蛋白表达情况。结果不同时间点低浓度、中浓度、高浓度TFRD组吸光度值与对照组比较均显著升高(P<0.05);4组矿化结节数统计,中浓度组高于其他三组,差异有统计学意义(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2 mRNA表达明显升高,PPARG mRNA表达明显降低(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2蛋白表达明显升高,PPARG蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论TFRD可促进BMSCs细胞增殖和成骨分化,其作用机制可能与上调β-catenin、RunX2表达,抑制PPARG表达有关。

鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导分化为内皮样细胞

目的:探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)的分离培养和血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其定向诱导为内皮样细胞(ELCs)的可行性。方法:采用Percoll(1.073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养基贴壁纯化培养,倒置显微镜、免疫细胞化学法、流式细胞仪、MTT法、透射电镜(TEM)联合对rBMMSCs形态、表型、生长曲线、细胞周期以及超微结构进行鉴定;诱导后的细胞,采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法检测CD31、CD144(VE-cadherin)和CD34表达以及摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点。结果:rBMMSCs呈长梭形,漩涡状排列。细胞生长曲线显示潜伏期、对数生长期和平台期,符合干细胞的生长规律。透射电镜结果表明:rBMMSCs有两种不同的形态结构,其中体积较小、核质比大、胞质内细胞器稀少者为处于未分化或分化较低状态的幼稚型rBMMSCs。细胞周期分析显示:第4代细胞G0/G1期为95.67%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态;诱导后的部分细胞形态可见类似ELCs改变,表达血管内皮细胞(ECs)特异性表面标志CD31、CD34和CD144,具有摄取Dil-ac-LDL以及结合FITC-UEA-1的功能特点。结论:采用Percoll密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法所培养的rBMMSCs在体外具有定向诱导分化为ELCs的潜能,可能成为血管组织工程理想的种子细胞来源。

过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞改善异位移植心脏存活

目的:探讨过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)改善大鼠腹腔异位移植心脏的存活机制。方法:通过慢病毒载体GV308携带IDO基因转染大鼠骨髓间充质干细胞构建过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞。建立大鼠腹腔异位移植心脏模型,经尾静脉给予相应细胞处理:(1)利用超声心动图检测移植心脏心功能变化。(2)采用小动物活体成像系统评估移植心脏局部荧光强度。(3)再取各组受体大鼠的脾脏,采用流式细胞技术检测CD40、CD86、CD80、MHCⅡ、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg细胞的表达情况。(4)取各组移植心脏,采用HE染色评估炎性细胞浸润情况。(5)利用液相芯片检测各组血清IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-18、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3因子的变化情况。结果:(1)给予相应细胞处理,可见过表达IDO-BMSCs处理后2 d移植心脏的EF、FS较其余各组有提高。(2)采用小动物活体评估可见过表达IDO-BMSCs组移植心脏局部荧光强度最强。(3)给予干预措施后2 d可见过表达IDO-BMSCs组脾脏细胞CD40、CD86、CD80、MHCⅡ、CD45RA、CD45RA+CD45RB表达降低,而CD274、Treg细胞的表达增高。(4)采用液相芯片检测各组提取血清可见在2 d时,过表达IDOBMSCs组血清中IL-1α、IL-4、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-18是降低的;IL-10、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3表达量是升高的。HE染色证实过表达IDO-BMSCs组炎性细胞浸润少于其他组。结论:过表达IDO的BMSCs可以通过有效调节免疫DC、T细胞及细胞因子,从多个免疫层面改善移植心脏存活。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的 观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别.方法 分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷（5-Aza）诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显徼镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I（cTnI）、缝隙连接蛋白43（Cx43）和心肌特异性转录因子4（GATA-4）的表达.结果 对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2～8周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组（P＜0.05）.结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞.

与韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞胶原蛋白和韧粘素-C表达的影响

骨髓间充质干细胞(BMSCs)可分化成多种细胞。已有研究表明,局部微环境影响细胞的生长、分化等功能,不同的细胞共培养可为细胞提供特定的环境。因此,本实验将大鼠BMSCs与大鼠韧带成纤维细胞间接共培养不同时间段后,检测其I型、III型胶原和韧粘素-C的mRNA表达以及I型、III型胶原的蛋白合成量。结果显示,体外培养6d,间接共培养组BMSCsI型胶原mRNA的表达量(3.9±0.2)是对照组(1.9±0.3)的2.0倍;间接共培养组BMSCsIII型胶原的表达量(1.9±0.2)是对照组(0.8±0.1)的2.2倍,而韧粘素-C的mRNA表达量两组间无明显差异。体外培养12d,间接共培养组BMSCs的I型和III型胶原mRNA表达量继续升高,它们的蛋白含量分别从对照组的12.4±0.8ng/μg和5.0±0.4ng/μg,增加到13.6±1.3ng/μg和5.9±0.5ng/μg;韧粘素-C的mRNA表达量(0.14±0.02)为对照组(0.07±0.02)的2.0倍。结果提示与韧带成纤维细胞间接共培养,可以促进BMSCsI型、III型胶原蛋白和韧粘素-C的合成。

福莫特罗和ICI118551对大鼠骨髓间充质干细胞来源的成骨样细胞功能的影响

目的:研究选择性β2肾上腺素能激动剂福莫特罗(Formoterol)和阻滞剂ICI118551对体外由大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)成骨分化的影响,探讨β2肾上腺素能受体信号对骨代谢的影响。方法:取3周龄雌性SD大鼠,全贴壁筛选法培养MMSC,用条件培养液诱导向成骨细胞分化后分别加入不同浓度Formoterol和ICI118551,检测细胞碱性磷酸酶,骨钙素的分泌水平和细胞增殖率。结果:MMSC成功诱导分化为成骨样细胞,不同浓度(10-5～10-9mmol/L)的Formoterol均可抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖。高浓度ICI118551(10-5和10-6mmol/L)抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖,低浓度ICI118551(10-8和10-9mmol/L)则可促进成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖。结论:β2肾上腺素能受体激动剂可抑制体外成骨样细胞的功能和细胞增殖,而阻滞剂对成骨样细胞功能和增殖的影响与其浓度有关。

氧化石墨烯对大鼠骨髓间充质干细胞生物活性的影响

目的探讨氧化石墨烯对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的影响。方法采用改良Hummers法制备氧化石墨烯,将不同浓度的氧化石墨烯溶液与大鼠骨髓间充质干细胞共培养,检测其对细胞增殖和形态的影响,相关结果采用SAS V8软件进行统计学分析。结果经表征分析,改良Hummers法可以成功制备出高纯度的氧化石墨烯。在细胞密度较低时,氧化石墨烯对大鼠骨髓间充质细胞的分裂增殖有抑制作用;而在细胞密度较高,达到生长接触抑制的浓度时,氧化石墨烯具有促进细胞死亡,降低活性细胞数量的作用。连续镜下观察后发现,氧化石墨烯对细胞形态有显著影响,可使细胞伸展性下降,折光率降低。这些细胞形态的变化与氧化石墨烯的浓度呈正相关。结论氧化石墨烯可抑制大鼠骨髓间充质干细胞的生物学活性,其作用呈浓度依赖性。

VEGF基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法:体外分离、培养、鉴定MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,转染后用免疫荧光和ELISA检测MSCs表达VEGF蛋白的情况,MTT检测MSCs对VEGF质粒转染的敏感性。结果:骨髓中分离得到MSCs,流式细胞检测显示MSCs不表达CD34和CD45,但表达CD90。透射电镜观察可见细胞浆中含大量粗面内质网和分泌颗粒。VEGF基因转染MSCs后第5天抗VEGF免疫荧光染色约90%的MSCs呈阳性,ELISA检测结果显示PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组细胞培养上清液中VEGF含量明显高于对照组,并于转染后第5天达到峰值。MTT检测结果显示VEGF质粒转染对MSCs增殖无影响。结论:MSC可作为VEGF基因转染的靶细胞用于基因治疗。

3.0T MR多序列示踪SPIO标记骨髓间充质干细胞在SCI大鼠模型中的对比研究

目的探索3.0T MR活体示踪移植SPIO标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠脊髓损伤(SCI)模型中的优选序列。方法采用贴壁法培养大鼠BMSCs,使用超低微浓度的菲立磁-硫酸鱼精蛋白(Fe-Pro)标记BMSCs,普鲁士蓝及核固红染色显示细胞内铁。将20只脊髓损伤(SCI)模型的SD大鼠,于建模后第7天在损伤区两侧局部多点注射Fe-Pro标记的BMSCs,并于移植后第14天行3.0T MR FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN序列成像,测量损伤区标记干细胞信号变化率及图像信噪比,并与脊髓组织切片普鲁士蓝染色对照。结果 20只SD大鼠BMSCs标记率为100%。脊髓普鲁士蓝染色显示,损伤区附近细胞质内大量细小蓝染颗粒。标记干细胞在3种MR序列图像上的信号变化率分别为(43.40±3.20)%、(77.80±3.59)%、(79.60±3.58)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),FSET2WI序列的信号变化率均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信号变化率,差异有统计学意义(P<0.05);3DFIESTA及ESWAN序列间信号变化率比较差异无统计学意义(P>0.05)。标记干细胞在3种MR序列图像信噪比分别为(20.95±1.91)、(45.70±9.40)、(44.50±8.29),组间比较差异有统计学意义(P<0.05),FSET2WI序列的信噪比均小于3DFIESTA及ESWAN序列的信噪比,差异有统计学意义(P>0.05);3DFIESTA及ESWAN序列间信噪比比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 3.0 T MR FSET2WI、3DFIESTA、ESWAN序列均可以检测到SPIO标记的BMSCs在大鼠脊髓内的MR信号,ESWAN序列效果最佳。