益气活血组方对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移和黏附的影响

目的:探究内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)的原代培养及鉴定方法,并探讨益气活血组方对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移和黏附的影响。方法:将EPCs随机分为空白血清组、5%、10%、15%含药血清组和对照组,以相应血清干预原代EPCs,并分别通过CCK8法、Transwell迁移实验、黏附实验评估对EPCs的增殖、迁移、黏附的影响。结果:空白血清组和含药血清组EPCs增殖、迁移、黏附能力均高于对照组(P<0.05或P<0.01)。10%、15%含药血清组EPCs增殖、迁移、黏附能力均高于空白血清组(P<0.05);10%、15%、5%含药血清组与空白血清组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:益气活血组方能提高大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移和黏附能力,且与含药血清浓度值呈正相关,并且血清浓度的平台值为15%,超过这个阀值时,血清浓度的增高对细胞的生长影响不大。

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的：目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低。实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法。方法：实验于2006-08/2007-08在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成。①实验材料：2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133,采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达。结果：①培养4d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长。培养7-10d,细胞集落相互连接,呈典型的＂鹅卵石＂样外观。2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈“微血管样”排列生长。②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增。

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景:内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的:体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法:密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论:骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。

骨髓来源的血管内皮祖细胞移植治疗实验性大鼠股动脉闭塞症观察

目的观察骨髓来源的血管内皮祖细胞 (EPC)移植治疗实验性大鼠股动脉闭塞症的可行性与疗效。方法建立实验性股动脉闭塞大鼠模型。分离纯化雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,经体外培养、扩增并诱导分化、体外BrdU标记后移植到 16只模型大鼠的右侧后肢 (A组 ) ,同体左侧相同部位注射生理盐水作为对照 (B组 )。分别在移植当天、移植后第 14天和第2 8天行双下肢激光多普勒扫描 ,并分别于移植后第 14天 (8只 )和第 2 8天 (8只 )处死动物取双下肢肌肉组织 ,行免疫组织化学 (FⅧ、BrdU )检查。结果移植后第 14天与移植当天、移植后第 2 8天与移植后第 14天相比 ,A组移植后下肢血流量增加 (P <0 .0 5 ) ;A组与B组相比 ,血流量亦增加 (P <0 .0 5 )。A组肌束间血管内皮细胞呈BrdU阳性染色 ,而B组则为阴性。平均每视野FⅧ染色阳性的毛细血管数目A组明显多于B组 (P <0 .0 1)。结论骨髓来源的EPC移植可增加缺血部位血流量和毛细血管的密度。

《中国肿瘤临床》文章推荐:髓源性抑制细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是浆细胞恶性增殖性疾病,目前为血液系统第二大肿瘤。虽然蛋白酶体抑制剂和免疫治疗方案的应用改善了MM患者的预后,但大多数仍然无法被治愈,主要是因为MM细胞最终产生耐药。髓源性抑制细胞(MDSCs)是骨髓中髓系祖细胞分化受阻而形成的具有显著抑制T细胞免疫应答功能的一群异质性细胞,通过介导免疫抑制性作用促进MM的发展。

原发性高血压条件下骨髓来源内皮祖细胞数量及功能的变化

目的了解原发性高血压对体外培养骨髓来源内皮祖细胞(EPC)数量及功能的影响。方法将自发性高血压大鼠(SHR)分为6、12周龄组,以同周龄正常血压Wistar-Kyoto(WKY)大鼠为对照。以密度梯度离心法分离骨髓来源单个核细胞体外培养,差速贴壁法培养7 d后收集贴壁细胞并行鉴定为骨髓来源内皮祖细胞,测定EPC数量、细胞增殖活力(MTT法)、NO分泌及细胞凋亡率。结果 6周龄SHR骨髓来源EPC数量与6周龄WKY大鼠比较差异无统计学意义(P>0.05),细胞增殖能力、NO分泌能力受损(P<0.05),凋亡率稍增多但差异无统计学意义(P>0.05)。12周龄SHR骨髓来源EPC数量与12周龄WKY大鼠比较明显减少(P<0.01),细胞增殖能力、NO分泌能力受损(P<0.01),凋亡增多(P<0.05)。结论随着SHR血压升高和原发性高血压病程延长,骨髓来源内皮祖细胞数量减少,功能减退,凋亡增多。

骨髓刺激对大鼠骨髓源内皮祖细胞的影响

目的观察大鼠骨髓刺激后骨髓源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的改变,探讨采用骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的可能机制。方法取12只SPF级雄性Lewis大鼠,体重200～250g,按是否皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子注射液分为刺激组和对照组(n=6)。取骨髓单个核细胞用EBM-2培养液进行诱导分化,培养7d后对贴壁细胞采用异硫氰酸荧光素-荆豆凝血素1和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白染色进行EPCs鉴定及计数;同时采用黏附能力测定实验观察EPCs的黏附能力。另取12只SPF级雄性Lewis大鼠制备单侧后肢缺血模型,在模型制备后3d将8×106个EPCs移植至缺血侧后肢的肌肉内,按照移植EPCs来源不同将后肢缺血大鼠分为刺激组和对照组(n=6)。EPCs移植3周后行后肢血管造影,计算缺血侧后肢侧支血管数目。结果大鼠骨髓单个核细胞培养7d后刺激组EPCs数量为(145.2±37.0)个/HP,大于对照组(95.2±39.4)个/HP(P<0.05);刺激组黏附EPCs数量为(21.8±4.3)个/HP,大于对照组(15.0±5.2)个/HP(P<0.05)。大鼠骨髓源EPCs移植至缺血肢体后3周,刺激组EPCs移植后缺血侧后肢侧支血管数目为(4.2±1.2)个,大于对照组的(2.7±0.8)个(P<0.05)。结论骨髓刺激使骨髓源EPCs数量增加、功能改善,可能是骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的机制之一。

大鼠骨髓来源的内皮祖细胞培养方法的优化

目的探索提取和培养内皮祖细胞的改良方法。方法采用密度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,接种于预包被纤维连接蛋白的培养皿中,使用不同的培养条件进行培养,利用差速贴壁法和差速消化法纯化经诱导培养得到的内皮祖细胞。对得到的内皮祖细胞进行体外成血管功能的鉴定后,比较不同培养条件下得到的内皮祖细胞的数量。结果使用M199培养基,添加10%FBS,10 ng/mLVEGF,5 ng/mL bFGF,2 ng/mL CSF的培养条件最适合内皮祖细胞的生长。结论经过提取和培养方法的改良,可以从大鼠骨髓中提取得到数量较多的成集落生长的内皮祖细胞,培养得到的内皮祖细胞在体外试验中表现出新生血管的能力。

脂蛋白(a)通过下调Notch信号通路抑制兔骨髓源性内皮祖细胞血管生成

目的研究脂蛋白(a)对兔骨髓源性内皮祖细胞血管生成的影响及其机制。方法采用密度梯度离心及差速贴壁法从新西兰白兔骨髓中分离培养内皮祖细胞(EPC)。实验共分4组:对照组、脂蛋白(a)组、Delta-like4(Dll4)(Notch信号通路激动剂)组,兴奋剂+脂蛋白(a)组。免疫荧光双抗及功能学鉴定EPC,matrigel胶血管样结构形成分析,实时定量PCR和Western blot分别检测Jag-1的mRNA和蛋白水平。结果脂蛋白(a)呈剂量依赖性对兔骨髓源性内皮祖细胞血管生成产生影响,在培养液中加入50 mg/L脂蛋白(a)24 h后,单位面积血管密度降低,单位面积血管的长度下降到50 mm/cm2,抑制血管生成37.5%+2.3%,随着脂蛋白(a)浓度的增加,损伤加重,在70 mg/L时单位面积血管的长度减少到38 mm/cm2,抑制率52.5%+2.8%,90 mg/L时达到24 mm/cm2抑制率70.0%+3.1%,低于50 mg/L时损伤变化不明显。加入Notch信号通路激动剂Dll4后,血管损伤减轻,密度增加,单位面积血管的长度在脂蛋白(a)浓度50 mg/L时由原来的50 mm/cm2恢复到72 mm/cm2,在90 mg/L血管长度时由原来的24 mm/cm2恢复到41 mm/cm2。而在Notch信号通路激动剂组,血管结构密度增加,单位面积血管样结构的长度达到120 mm/cm2,PCR和Western blot检测Jag-1的mRNA和蛋白表达增加,说明脂蛋白(a)对血管生成的影响通过Notch信号通路实现。结论脂蛋白(a)通过下调Notch信号通路抑制兔骨髓源性内皮祖细胞血管生成。

通过骨髓移植建立骨髓源性细胞特异性基因修饰小鼠模型

目的:通过骨髓移植建立骨髓源性细胞特异性基因修饰小鼠模型。方法:将具有相同遗传背景的供体小鼠(C57BL/6野生型小鼠)的骨髓细胞移植到经X射线辐照的受体小鼠(C57BL/6 Ep3^(-/-)小鼠)中,通过不同辐射剂量和方式的对比,确定基因修饰小鼠骨髓移植实验的最适辐照方案。提取受体小鼠血液和鼠尾组织DNA进行基因型鉴定和嵌合率分析。结果:受体小鼠经合适剂量的X射线辐照(辐射剂量为8.0 Gy,分2次照射,每次4.0 Gy,中间间隔6 h),小鼠存活率可达到(74.3±2.4)%,嵌合率(95.77±0.52)%,符合骨髓移植实验要求。结论:成功建立了符合骨髓移植实验要求的骨髓源性细胞特异性基因修饰小鼠模型,可用于心血管及炎症等相关的研究工作。

共培养下脂肪源性干细胞对内皮祖细胞活性的影响及其相关机制

目的 探讨脂肪源性干细胞(ADSC)与内皮祖细胞(EPC)共培养对EPC活性的影响及ADSC对EPC增殖、迁移、分化及成血管活性产生影响的机制。方法 体外分离、培养、扩增并鉴定大鼠来源的ADSC与EPC。实验分为EPC组、EPC+ADSC共培养组、EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,三组细胞使用Transwell共培养处理48 h后,分别通过CCK-8实验、划痕实验和血管形成实验评估ADSC与EPC共培养和PI3K/AKT通路对EPC活性的影响;通过Western blot检测EPC中血管内皮生长因子A(VEGFA)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮细胞钙粘连蛋白(VE-cadherin)、CD133、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表达水平来探究ADSC与EPC共培养和PI3K/AKT通路对EPC向成熟内皮细胞分化能力的影响。结果 CCK-8检测结果显示,EPC+ADSC共培养组中EPC在不同时间点吸光度值均高于EPC组和EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,差异有统计学意义(P<0.01);划痕实验结果显示,EPC+ADSC共培养组24 h后划痕相对距离小于EPC组和EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,差异有统计学意义(P<0.01);血管形成实验结果显示,EPC+ADSC共培养组24 h形成管腔样结构平均数量高于EPC组和EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测显示,EPC+ADSC共培养组中EPC的VEGFA、eNOS、VE-cadherin、p-PI3K和p-AKT表达水平高于EPC组和EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,而CD133表达水平低于EPC组和EPC+ADSC+PI3K-inhibitor组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ADSC与EPC共培养能够提高EPC增殖、迁移、分化和成血管等活性,其机制可能是通过调控PI3K/AKT通路实现的。

大鼠脾源性内皮祖细胞培养及鉴定

目的培养、鉴定大鼠脾源性内皮祖细胞。方法机械损伤大鼠脾脏,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,富含胎牛血清EMDM培养液培养,观察细胞形态,将培养第7天内皮祖细胞与DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白37℃孵育4 h,以检测内皮祖细胞对DiI-乙酰化低密度脂蛋白的摄取,再用20 g/L多聚甲醛固定细胞10 min,固定后用PBS浸洗,将FITC标记的凝集素Ⅰ加入上述标本,37℃孵育1 h,PBS浸洗,通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-凝集素Ⅰ和DiI-乙酰化低密度脂蛋白。结果贴壁细胞呈现类圆形、纺锤形或多边形,7～14 d可见部分贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观。胞浆摄取DiI-乙酰化低密度脂蛋白显示红色,胞膜结合FITC-凝集素Ⅰ显示绿色,双染色阳性细胞为黄色,为正在分化的内皮祖细胞。结论大鼠脾源性内皮祖细胞分离、培养简单、可行。

糖基化终末产物对大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖、凋亡和管腔形成的影响

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)动员及生物功能的影响。方法:采用不同浓度牛血清白蛋白糖基化终末产物(BSA-AGEs)(50～200mg/L)分别作用EPCs(0～24h),检测EPCs的增殖、凋亡及管腔形成能力的变化。结果:随着AGEs浓度增加及作用时间的延长,EPCs的凋亡率升高,而增殖及管腔形成能力降低(P<0.05)。结论:AGEs对EPCs的存活和增殖具有损害作用,而且还对EPCs功能有破坏作用。

大鼠骨髓源内皮祖细胞的分离与鉴定

目的:建立大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的分离与鉴定方法。方法:取大鼠双侧股骨和胫骨骨髓腔细胞,采用密度梯度离心法、组织淋巴细胞分离液分离单个核细胞,将细胞过滤离心后置于含20%FBS的DMEM低糖完全培养基中培养;采用流式细胞仪鉴定EPCs细胞表面标志物CD34、CD133及VEGFR2的表达。结果:细胞培养2 d后可观察到梭形的贴壁细胞,培养7 d后细胞呈克隆样集落,流式细胞仪鉴定为EPCs细胞的特征。结论:大鼠骨髓中可提取并分化出质量较好的EPCs细胞。

低频脉冲磁场对大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖和体外血管化的影响

目的观察不同强度低频脉冲磁场对体外培养大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖、细胞周期、迁移和成血管能力的影响。方法密度梯度离心法获得大鼠骨髓源内皮祖细胞,随机分为4组:对照组,1.0mT组,1.4mT组和1.8mT组。除对照组外,其余各组用频率为15Hz不同强度的方波脉冲磁场刺激大鼠骨髓源内皮祖细胞,2h/d,持续刺激5d。曝磁5d后,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,划痕试验检测细胞迁移能力,管状结构形成试验和3维培养检测细胞成血管能力。结果1.0mT组和1.4mT组磁场促进内皮祖细胞增殖,使其细胞周期分布发生改变,DNA合成期(S期)和合成后期(G2期)细胞比例增加,1.8mT组磁场也能促进内皮祖细胞增殖,但对细胞周期分布影响不明显。体外培养内皮祖细胞迁移能力差,各强度磁场对其迁移能力也无明显影响。不同强度磁场均能够提高内皮祖细胞成血管能力,与对照组相比差异均有统计学意义[(14.0±1.6)比(11.0±1.6);(19.2±1.9)比(11.0±1.6);(15.4±1.1)比(11.0±1.6),P均<0.05]。1.0mT和1.4mT磁场作用强于1.8mT磁场。结论磁场的生物学作用和磁场强度相关,1.0mT和1.4mT低频脉冲磁场促进大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖和DNA合成并提高其成血管能力。

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及其生物学特性

目的:探讨大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养方法及其生物学特性。方法:采用二次贴壁法体外扩增培养大鼠骨髓内皮祖细胞,观测细胞增殖能力;免疫化学检测细胞CD133、CD34、Flk1、CD31的表达;三维培养细胞并观察其体外成血管能力。结果:细胞培养第4天集落样生长,呈圆形或梭形;第10天细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。原代血管内皮祖细胞CD133、CD34、Flk1均表达阳性;第2代细胞CD34、CD31、Flk1均表达阳性,CD133表达阴性。三维培养第2代血管内皮祖细胞在胶原内有"出芽式"生长现象及管腔样结构形成。结论:体外扩增法可以从骨髓中分离培养出内皮祖细胞,三维培养发现其具有体外成血管能力。

健脾补肾活血方对大鼠骨髓源内皮祖细胞生物学功能的影响

目的:探讨健脾补肾活血方对大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖、迁移及黏附的影响。方法:体外分离培养大鼠骨髓源内皮祖细胞,设空白对照组、健脾补肾活血方低剂量组(0.35 g/ml)、健脾补肾活血方中剂量组(0.65 g/ml)、健脾补肾活血方高剂量组(1.0 g/ml)。药物干预24 h后,MTT法检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移能力,黏附实验检测细胞黏附能力。结果:与空白对照组比较,不同浓度的健脾补肾活血方以剂量依赖方式显著提高大鼠骨髓源内皮祖细胞的增殖水平,促进细胞迁移,增强细胞的黏附能力,且健脾补肾活血方高剂量组对细胞增殖、迁移及黏附的影响最大。结论:健脾补肾活血方能促进大鼠骨髓源内皮祖细胞的增殖、迁移及黏附功能,具有恢复细胞生物学功能的作用。

微孔法分离大鼠骨髓内皮祖细胞

用一种杂交瘤皿,根据内皮祖细胞集落形成单位(endothelial progenitor cells colony-forming units,EPCs-CFUs)的形态特征和EPCs表面特异性标记物分离EPCs.取大鼠股骨、胫骨骨髓,将全骨髓接种在聚苯乙烯制作的杂交瘤皿上,培养4～7天后出现CFUs,将这些集落分别挑选出来后,取单个集落的部分细胞免疫荧光鉴定EPCs表面特异性标记物CD133/VEGFR-2.CD133/VEGFR-2双阳性即为EPCs-CFUs.与此对应的余下一部分继续传代增殖,流式细胞术鉴定CD133/VEGFR-2/CD34,并把此方法命名为微孔法.发现接种后第4天,显微镜下可见明显的CFUs.免疫荧光鉴定大约7%的CFUs为CD133+/VEGFR-2+,进一步传代培养,流式细胞术鉴定CD133+/VEGFR-2+/CD34+细胞纯度达70%以上.传代细胞可在体外形成血管样结构,并表达内皮细胞特异性标记物vWF.结果表明通过微孔法能成功地从大鼠骨髓分离到EPCs.

干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子对单侧输尿管梗阻大鼠骨髓干细胞及内皮祖细胞的动员作用

目的探讨干细胞因子(SCF)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠骨髓干细胞及内皮祖细胞的动员作用。方法56只Wistar大鼠随机分为7组:正常对照组、SCF组、G-CSF组、SCF联合G-CSF组(SCF-G组)、假手术组、UUO组、SCF联合G-CSF用于UUO组(UUO+SCF-G组)。实验第5天采集血标本后:①流式细胞仪检测静脉血单个核细胞中CD34+、CD34+/CD133+细胞;②检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐水平。结果①对照组大鼠静脉血单个核细胞中CD34+细胞为(0.13±0.01)%,假手术组CD34+细胞为(0.24±0.06)%与对照组比较差异无显著性(P>0.05);其余各组与对照组比较CD34+细胞百分率均明显增高(P<0.05),以UUO+SCF-G组(3.04±0.42)%及SCF-G组(2.10±0.28)%增高最为明显;②对照组大鼠静脉血单个核细胞中CD34+/CD133+细胞为(0.02±0.01)%,假手术组CD34+/CD133+细胞(0.05±0.02)%与对照组比较差异无显著性(P>0.05);其余各组与对照组比较CD34+/CD133+细胞百分率均明显增高(P<0.05),以UUO+SCF-G组(0.73±0.17)%增高最为明显;③7组血清尿素氮,肌酐、谷丙转氨酶水平无明显增高,UUO组谷草转氨酶水平较其他6组增高,差异有显著性。结论SCF和G-CSF对干细胞和内皮祖细胞的动员效果并非完全呈平行关系,联合使用可提高内皮祖细胞和干细胞的动员率,短期内未见肝、肾毒副作用。

小鼠髓源性内皮祖细胞体外培养的两种不同分离方法的比较

目的比较密度梯度离心和红细胞裂解法分离体外培养小鼠髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)的优缺点。方法选用4周龄的C57BL/6小鼠,密度梯度离心和红细胞裂解法分离小鼠骨髓细胞,进行细胞计数、检测细胞活率,差速贴壁纯化BM-EPCs,定期镜下观察细胞的形态。培养7 d后,流式细胞仪检测细胞表面CD_(34)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、CD_(31)的表达;1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青标记的乙酰化低密度脂蛋白(Di L-ac LDL)摄取和异硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)结合能力经双染后激光共聚焦显微镜拍照进行检测;培养14 d进行免疫荧光检测CD_(31)的表达。结果密度梯度离心和红细胞裂解法提取两种方法均能分离BM-EPCs进行体外培养,与密度梯度离心方法比较,红细胞裂解法操作更为简便,获得的细胞数量较多[(1.90±0.55)×10~7比(0.72±0.42)×10~7](P<0.05),细胞存活率较高[(95.25±1.03)%比(83.75±1.93)%](P<0.01),细胞表面CD_(34)、VEGFR-2表达、Dil-acLDL和FITC-UEA-1双染阳性的细胞比例低于密度梯度离心分离法[(30.03±2.40)%比(46.93±2.89)%,(28.70±6.51)%比(43.97±1.39)%,(78.30±4.27)%比(89.20±2.65)%],培养14 d后的CD_(31)阳性细胞比例低于密度梯度离心分离法[(84.10±3.86)%比(93.57±4.27)](P<0.05)。结论两种分离方法均能分离BM-EPCs进行体外培养,提取方法各有利弊,可结合研究方案进行选择。