SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。

小分子组合诱导大鼠胚胎成纤维细胞重编程为功能性神经元

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞。方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质。结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%。包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%。以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC。其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少。神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少。结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC。

生姜提取物对染铝毒大鼠学习记忆功能和神经细胞结构的影响及其可能作用机制

目的分析生姜提取物(GRE)对铝染毒大鼠学习记忆功能及神经细胞结构的影响,并基于钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、蛋白激酶C(PKC)探讨其可能的作用机制。方法将36只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、铝染毒组、临床药物组、低剂量GRE(L⁃GRE)组、中剂量GRE(M⁃GRE)组、高剂量GRE(H⁃GRE)组,每组6只大鼠。空白对照组大鼠自由饮用不含氯化铝的饮用水,其余组大鼠饮用含10 mg/mL结晶氯化铝的饮用水。3个月后给予空白对照组和铝染毒组大鼠灌胃生理盐水,临床药物组大鼠灌胃盐酸多奈哌齐溶液,分别给予L⁃GRE组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠灌胃100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg GRE溶液。持续干预4周后,采用Morris水迷宫实验评估大鼠的学习记忆功能,通过HE染色观察大鼠海马组织形态变化,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测大鼠海马组织CaMKⅡ、nNOS、PKC mRNA和蛋白表达水平。结果(1)与空白对照组相比,铝染毒组大鼠的逃避潜伏期延长且穿越平台次数减少(P<0.05),海马组织的神经细胞皱缩,神经细胞数量明显减少,CaMKⅡ、nNOS、PKC的mRNA表达水平及nNOS、PKC的蛋白表达水平降低(P<0.05)。(2)与铝染毒组比,L⁃GRE组、M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期缩短,临床药物组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的穿越平台次数增加(P<0.05);各给药组大鼠海马组织病理形态有不同程度的改善;临床药物组大鼠的CaMKⅡ、nNOS和PKC mRNA表达水平升高,各剂量GRE组大鼠nNOS和PKC mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。(3)与临床药物组相比,M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期,以及各剂量GRE组的穿越平台次数和目标象限停留时间差异无统计学意义(P>0.05);各剂量GRE组大鼠海马组织病理形态改善程度更为明显;M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的nNOS、PKC蛋白表达水平升高,L⁃GRE组大鼠的nNOS蛋白表达水平升高(P<0.05)。(4)各剂量GRE组组间大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留时间差异无统计意义(P>0.05);随GRE干预剂量增加,大鼠海马组织病理形态的改善效果越明显;H⁃GRE组大鼠的CaMKⅡmRNA表达水平高于L⁃GRE组(P<0.05)。结论GRE能够改善铝染毒大鼠的神经细胞结构和学习记忆功能,其中对神经细胞结构的改善效果优于盐酸多奈哌齐,对学习功能的改善效果与盐酸多奈哌齐相当。GRE的作用机制可能与拮抗铝所致CaMKⅡ、nNOS和PKC表达水平下降有关。

LncRNA CYTOR对大鼠背脊髓神经元细胞损伤及炎性因子的影响

目的探讨LncRNA CYTOR对大鼠背脊髓神经元细胞损伤及炎性因子的影响及其可能作用机制。方法采用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导大鼠背脊髓神经元细胞建立细胞损伤模型,随机分为:con组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+pcDNA组、H^(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR组、H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC组、H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p组。qRT-PCR检测LncRNA CYTOR、miR-136-5p的表达量;MTT法与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-6、IL-21的水平;双荧光素酶报告实验检测LncRNA CYTOR与miR-136-5p的靶向关系;Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果与con组比较,H_(2)O_(2)组LncRNA CYTOR的表达量降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),miR-136-5p的表达量升高(P<0.05),细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),IL-6、IL-21的水平升高(P<0.05);与H_(2)O_(2)+pcDNA组比较,H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR组细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达及IL-6、IL-21水平均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);LncRNA CYTOR可负向调控miR-136-5p表达;与H_(2)O_(2)+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-NC组比较,H 2O 2+pcDNA-LncRNA CYTOR+miR-136-5p组细胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表达及IL-6、IL-21水平均升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论LncRNA CYTOR过表达可通过抑制miR-136-5p表达而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎性反应从而减轻H_(2)O_(2)诱导的大鼠背脊髓神经元细胞损伤。

映山红花总黄酮促进大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性H_(2)S的关系

目的探讨映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)促大鼠脑血管内皮细胞体外形成血管作用及与VEGFR_(2)和神经源性硫化氢(H_(2)S)的关系。方法采用大鼠脑血管内皮细胞单独培养及和与海马神经元共培养,分别采用不同的实验方法检测细胞增殖、迁移、成管及H_(2)S含量和钙离子荧光强度,包括CCK-8法、细胞划痕法、Transwell法、基质胶成管、H_(2)S试剂盒及钙离子荧光探针法。结果在单独培养的大鼠脑血管内皮细胞上,H_(2)S供体NaHS(200μmol·L^(-1))和TFR(90、270、810 mg·L^(-1))对大鼠脑血管内皮细胞的增殖、迁移、成管及[Ca^(2+)]i荧光强度都有明显的促进作用。而VEGFR_(2)阻断剂SU5416(10μmol·L^(-1))可抑制TFR的促进内皮细胞增殖、迁移和形成血管及[Ca^(2+)]i荧光强度;在与海马神经元共培养的大鼠脑血管内皮细胞上,TFR显著地升高共培养中H_(2)S含量,并被CBS抑制剂AOAA(200μmol·L^(-1))抑制。与此同时,TFR明显地促进共培养中大鼠脑血管内皮细胞的形成血管作用,并可被AOAA和VEGFR_(2)阻断剂SU5416显著地抑制。结论TFR在体外可通过VEGFR_(2)升高[Ca^(2+)]i来促进脑血管内皮细胞形成血管,并可通过诱导神经元中CBS生成H_(2)S作用于大鼠脑血管内皮细胞的VEGFR_(2)来促进血管形成。

氨溴索对α-突触核蛋白寡聚体诱导鼠多巴胺能神经元细胞株MES23.5损伤的预防作用观察

目的观察氨溴索(AMB)对α-突触核蛋白(α-syn)寡聚体诱导鼠多巴胺能神经元细胞株MES23.5(帕金森病模型细胞)损伤的预防作用。方法将MES23.5细胞分为A、B、C、D组4组,A组细胞加入二甲基亚砜,B组细胞加入终浓度为5μmol/L的α-syn寡聚体,C组细胞加入终浓度为100μmol/L的AMB,D组细胞先加入终浓度为100μmol/L的AMB预处理12 h后再加入终浓度为5μmol/L的α-syn寡聚体。各组继续培养24 h后,采用ELISA法测算细胞β-葡萄糖脑苷脂酶(GCase)活性和α-syn寡聚体水平,采用MTT法检测细胞增殖能力(以OD_(450)值表示),使用JC-1探针检测线粒体膜电位,采用Western Blotting法检测酪氨酸羟化酶(TH)磷酸化水平。结果B组细胞GCase活性均低于其余三组(P均<0.05),C组细胞GCase活性均高于其余三组(P均<0.05)。B组细胞中α-syn寡聚体水平均高于其余三组(P均<0.05),C组细胞中α-syn寡聚体水平均低于其余三组(P均<0.05)。与A组相比,B组细胞培养24、48、72 h的OD_(450)值均降低(P均<0.05),D组细胞培养72 h的OD_(450)值降低(P<0.05);与B组相比,C、D组细胞培养24、48、72 h的OD_(450)值均升高(P均<0.05);与C组相比,D组细胞培养24、72 h的OD_(450)值均降低(P均<0.05)。B组细胞线粒体膜电位均低于其余三组(P均<0.05),D组细胞线粒体膜电位均低于A、C组(P均<0.05)。B组细胞TH磷酸化水平均低于其余三组(P均<0.05),C组细胞TH磷酸化水平均高于其余三组(P均<0.05)。结论AMB可通过升高GCase活性、降低α-syn寡聚体水平,恢复MES23.5细胞增殖能力、线粒体膜电位、TH磷酸化水平,对α-syn寡聚体诱导的细胞损伤起预防作用。

转录因子组合诱导大鼠星形胶质细胞转分化为多巴胺能神经元

目的:探究不同转录因子组合诱导大鼠海马星形胶质细胞(AS)转分化为多巴胺(DA)能神经元表型的效率。方法:构建表达特定的转录因子的重组慢病毒,包括MLN组合(Mash1、Lmx1a和Nurr1)、MNNg组合(Mash1、Nurr1和Ngn2)、LNNg组合(Lmx1a、Nurr1和Ngn2)以及MLNg组合(Mash1、Lmx1a和Ngn2),分别感染大鼠AS,利用免疫荧光染色检测细胞中神经元微管蛋白(Tuj1)、酪氨酸羟化酶(TH)、微管相关蛋白2(MAP2)、多巴脱羧酶(DDC)和突触素1(SYN1)的表达。结果:成功构建出携带有不同转录因子组合的重组慢病毒载体,且能够在细胞内正常表达。在慢病毒感染海马AS第14和28 d,MLN组合分别诱导出20%和60%左右的TH阳性DA能神经元,第28 d时LNNg组合诱导出20%左右TH阳性的DA能神经元,MLNg和MNNg组合仅诱导出Tuj1阳性神经元,进一步染色发现MLN组合能够诱导出多种成熟神经元标记物MAP2、DDC及SYN1表达。结论:转录因子间的协同作用是DA能神经元诱导成功的重要条件,MNNg、LNNg和MLNg组合未能有效诱导大鼠海马AS表达DA能神经元表型,MLN组合仍是高效诱导DA能神经元表型的转录因子组合。

黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及机制

目的探讨黄芩素对缺氧致大鼠皮质神经元细胞损伤的保护作用及可能机制。方法以大鼠皮质神经元RN-C细胞为研究对象,以缺氧条件(5%CO_(2)、94%N2、1%O_(2))培养24 h,考察不同浓度黄芩素(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)对缺氧RN-C细胞存活率的影响,并检测黄芩素(浓度为0.1μmol/L)对缺氧细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,细胞迁移率、凋亡率和细胞周期,以及对缺氧细胞中活化的胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。结果与对照组比较,缺氧组细胞的存活率显著降低(P<0.01);0.01、0.1、1μmol/L黄芩素可以逆转缺氧导致的细胞存活率降低(P<0.05或P<0.01)。划痕实验显示,黄芩素可显著升高缺氧RN-C细胞的迁移率(P<0.01)。与对照组比较,缺氧组细胞上清液中LDH活性、细胞中MDA含量、凋亡率和G1期细胞比例显著增加,SOD活性、G2+S期细胞比例显著降低(P<0.01);细胞中cleaved caspase-3蛋白的表达量显著上升,Bcl-2/Bax比值均显著下降(P<0.05或P<0.01)。与缺氧组比较,黄芩素组细胞显著逆转了上述指标(P<0.01)。结论黄芩素能促进缺氧条件下大鼠皮质神经元细胞的增殖和迁移,改善缺氧诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞,降低上清液中LDH活性,降低细胞脂质过氧化水平,提高抗氧化水平;其机制可能与调控caspase-3/Bax/Bcl-2通路有关。

水苏碱调节Hippo-YAP信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用

目的探究水苏碱(stachydrine,STA)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠的神经保护作用,并分析其作用机制。方法将新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD组、STA低剂量(5 mg/kg)组、STA中剂量(10 mg/kg)组、STA高剂量(20 mg/kg)组、维替泊芬(10 mg/kg)+STA高剂量(20 mg/kg)组,除假手术组外,其余大鼠构建HIBD大鼠模型。对各组大鼠进行神经功能缺损评分,采用Morris水迷宫实验进行认知功能评价,测定各组大鼠脑含水量和脑指数,HE染色、尼氏染色观察脑组织神经元损伤,TUNEL染色观察脑组织神经元细胞凋亡情况,Western blot法检测YES相关蛋白(YES associated protein,YAP)、p-YAP、哺乳动物STE20样蛋白激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、p-MST1、具有PDZ基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)蛋白表达。结果与假手术组比较,HIBD组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05);与HIBD组相比,STA低、中、高剂量组海马组织损伤改善,尼氏小体增加(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著降低(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著增加(P<0.05);与STA高剂量组相比,维替泊芬+STA高剂量组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05)。结论STA可能通过调控Hippo-YAP信号通路、减少神经损伤和神经元细胞凋亡、改善神经功能,发挥对HIBD新生大鼠的神经保护作用。

GSK-3β在大鼠背根神经节神经元细胞内质网应激中的作用机制研究

目的:探讨GSK-3β在大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞内质网应激中的可能机制。方法:将大鼠DRG神经元细胞分为4个组,空白对照组(C组)、衣霉素组(TM组)、衣霉素+GSK-3β抑制剂A014418组(TM+A组)、GSK-3β抑制剂A014418组(A组)。采用2μg/mL TM孵育24 h构建大鼠DRG神经元细胞内质网应激模型。C组不加入药物,TM组、TM+A组培养基中TM浓度为2μg/mL,TM+A组、A组培养基中A014418浓度为10μmol/L。用CCK-8检测法检测各组大鼠DRG神经元细胞活性,实时荧光定量PCR检测大鼠DRG神经元细胞GSK-3βmRNA、内质网分子伴侣BIP mRNA及细胞凋亡相关Bax、Bcl-2mRNA的表达,Western blotting法检测大鼠DRG神经元细胞GSK-3β、p-GSK-3β、BIP及Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:与C组比较,TM组、TM+A组大鼠DRG神经元细胞存活率降低(均P<0.05),BIP、Bax mRNA和蛋白表达上调(均P <0.05),Bcl-2mRNA和蛋白表达下调(均P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达下调,p-GSK-3β/GSK-3β的比值降低(均P<0.05);与C组比较,TM组GSK-3βmRNA表达上调(P<0.05),TM+A组、A组GSK-3βmRNA表达下调(均P<0.05);与TM组比较,TM+A组大鼠DRG神经元细胞存活率明显升高(P <0.05),Bax、BIP mRNA和蛋白表达下调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达上调(均P<0.05),pGSK-3β蛋白表达上调,p-GSK-3β/GSK-3β的比值升高(均P<0.05)。结论:抑制GSK-3β磷酸化,可以减轻由TM诱导大鼠DRG神经元细胞内质网应激反应,减少细胞凋亡。

银杏内酯B对成年大鼠神经干细胞向神经元分化的促进作用

目的 探讨银杏内酯B对神经干细胞分化为神经元的促进作用。 方法 采用无血清培养和单克隆实验技术在体外分离培养出大量来源于同一细胞的单细胞克隆球 ,并将其均匀种植于 2 4孔培养板中 ,分 3组分别加入含银杏内酯B、BDNF和不加任何细胞因子的完全培养液。培养 7d和 14d后终止 ,用神经元特异性标记物微管相关蛋白 2 (MAP 2 )的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,荧光显微镜下观察和计数MAP 2标记的阳性细胞并对细胞面积和周长进行图像处理。 结果 两个时期银杏内酯组MAP 2阳性细胞数均明显多于单纯对照组而少于BDNF组 ;分化 7d和 14d时银杏内酯组MAP 2阳性细胞的面积和周长明显大于单纯对照组 ,而略小于BDNF组。结论 银杏内酯B亦具有类似BDNF促进神经干细胞分化为神经元的作用。

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。

电刺激对大鼠脑梗塞康复中星形细胞与神经元的影响

目的:探讨大鼠急性脑梗塞后的康复机制。方法:用易卒中型双肾双夹型肾血管性高血压大鼠复制大脑中动脉闭塞模型,随机分为电刺激治疗组（简称治疗组）和对照组,用走平衡木法评价大鼠康复功能。于电刺激治疗后第1、3、6、9周末在脑梗塞灶边缘区观察神经元与星形胶质细胞的超微结构,胶质酸性蛋白表达,神经丝蛋白和微管相关蛋白2表达,神经元凋亡及脑微血管舒张情况。结果:治疗组从3～9周末瘫痪肢体功能恢复较对照组明显,在脑梗塞边缘区上述表达及脑微血管舒张数量均较对照组高（P<0.05）。结论:电刺激治疗可以促进瘫痪肢体功能恢复,其机理可能是电刺激增加星形胶质细胞增殖,增强神经元活性,激发脑微血管舒张。

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。

多种中药成分诱导大鼠骨髓间质干细胞转变为神经元样细胞

目的 体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞 (MSCs)分化为神经元样细胞。方法 通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养 ,流式细胞仪检测其表面抗原表达 ,中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果 大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD1 4、CD1 1α、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性 ,CD2 9、CD44、CD90、CD1 0 5、CD1 66呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导 1～ 3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (nestin)呈阳性 ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)阴性。

龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

[目的]观察龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。[方法]采用龟板含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞,免疫组化鉴定神经丝蛋白(NFP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。[结果]成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟板血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性,诱导后12 h,神经元样细胞NF阳性表达达到高峰。[结论]龟板含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。

督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生的影响。方法将对照组、神经干细胞移植组、督脉电针组和督脉电针+神经干细胞移植组的成年大鼠胸10脊髓段做全横断损伤;其中神经干细胞移植组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞。电针组和电针神经干细胞移植组在术后开始接受督脉电针治疗。所有动物存活67d。结果1.电针神经干细胞移植组脊髓损伤处的去甲肾上腺素能5、_羟色胺受体、降钙素基因相关肽能和生长相关蛋白-43阳性染色的4种神经纤维均明显多于其他几组。2.电镜下可观察到脊髓横断处有再生的神经纤维穿越,在电针神经干细胞移植组尤为明显。3.大脑体感运动区皮质和中脑红核受损伤的神经元存活数量也多于其他几组,一些神经元的再生神经纤维可能穿越横断处,进入尾端脊髓组织。结论督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生。

大鼠腰髓背角星形胶质细胞对外伤性疼痛刺激的反应及其与神经元关系的免疫电镜研究

本研究采用抗缝隙连接蛋白 43 ( Cx43 )和抗缝隙连接蛋白 3 2 ( Cx3 2 )免疫电镜双标记方法 ,观察了一侧胫、腓骨骨折后大鼠腰髓背角星形胶质细胞与神经元的超微结构改变。结果发现 ,在脊髓背角星形胶质细胞与神经元之间的结合区域存在着如下的超微结构 :( 1)轴突终末直接与星形胶质细胞突起 ( Cx43阳性 )形成一种突触样结构 ;( 2 )由神经元突触前膜、突触后膜及星形胶质细胞突起形成的“三方突触结构”;( 3 )星形胶质细胞与星形胶质细胞之间的缝隙连接 ;( 4 )新发现的由一侧的神经元( Cx3 2阳性 )和另一侧的星形胶质细胞突起 ( Cx43阳性 )组成的一种超微结构 ,骨折后此结构数目显著增高 ,可能是缝隙连接的同源结构 ,暂称为异源性缝隙连接。结果提示 :异源性缝隙连接结构可被疼痛刺激激活 。

不同培养代数大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞转分化能力的比较

为确定诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)向神经元样细胞转分化的适宜培养代数,本研究比较了不同培养代数的BMSCs的转分化潜能。首先体外培养大鼠BMSCs并传代,于不同的培养代数利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、全反式维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导分化,随后运用免疫荧光法和免疫印迹法检测诱导细胞中的神经元样细胞。结果显示骨髓基质细胞体外培养1至3代时能够被诱导分化为神经元样细胞,培养至第7代时丧失转分化为神经元样细胞的潜能。上述结果提示:传代次数增多将引起BMSCs自发分化,使其向神经元样细胞转分化的能力下降,因而BMSCs培养至第3代时适宜进行诱导分化。

盐酸法舒地尔体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性

目的:探讨Rho/Rho激酶(ROCK)抑制剂盐酸法舒地尔体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性。方法:全骨髓培养法分离培养大鼠骨髓MSCs,用200μmol/L盐酸法舒地尔诱导分化。倒置显微镜观察诱导不同时间细胞的形态学变化;AO-EB染色法鉴定诱导后细胞存活率;免疫荧光法鉴定诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF200)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,判断其分化情况。结果:盐酸法舒地尔诱导30、60、90、120及180min后细胞存活率分别为(96.7±2.2)%、(95.3±1.9)%、(93.8±1.8)%、(92.5±2.1)%及(90.1±1.3)%,其中以盐酸法舒地尔诱导120min后,形态变化最为理想。盐酸法舒地尔诱导60、90、120及180min后,NSE阳性表达率分别为(66.5±1.9)%、(88.1±3.2)%、(93.6±1.9)%和(93.5±5.4)%,NF200阳性表达率分别为(70.1±2.9)%、(89.5±1.3)%、(98.1±1.6)%和(98.3±1.9)%,而GFAP阳性表达率均小于5%。结论:盐酸法舒地尔可在体外快速、高效地诱导大鼠MSCs向神经元样细胞分化。