肝片吸虫天冬氨酰内肽酶的原核表达及反应原性分析

为了获得肝片吸虫天冬氨酰内肽酶(Fasciola hepatica legumain, FhLEG)基因的重组蛋白,分析其作为诊断抗原的可能性,试验根据GenBank中公布的FhLEG基因序列(登录号为AJ314846)设计特异性引物,以肝片吸虫总RNA为模板通过RT-PCR方法获得FhLEG基因,经克隆后测序并利用DNAStar 7.1、ExPASy和SWISS MODEL软件进行生物学分析。构建表达重组质粒pET-28a(+)-FhLEG,在大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中诱导表达,对表达后的LEG蛋白进行SDS-PAGE检测,纯化后进行Western-blot分析。结果表明:扩增得到的FhLEG核苷酸序列大小为1 260 bp, A+T含量为56.9%,与GenBank中收录的肝片吸虫LEG核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.6%和99.3%。LEG蛋白主要由6个α-螺旋、3个β-折叠和1个β-转角构成,具有较好的抗原表位,推测该蛋白可能具有较好的抗原性。经SDS-PAGE电泳,在51 ku处检测到目的条带,重组蛋白FhLEG与肝片吸虫阳性血清发生反应,而与阴性血清不发生反应。说明肝片吸虫天冬氨酰内肽酶具有良好的反应原性。