大豆天冬氨酸途径关键酶基因GmASADH的克隆与分析

本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 130bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1(FJ581425)和GmASADH2(HM015631)。GmASADH1编码区长度为1 134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1 131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann super-family和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。

lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA。摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8%。进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5%,较出发菌株分别提高29.5%和33.9%,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础。

痢疾杆菌体内诱导基因筛选方法的建立

分别用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)作为报告基因,用小鼠肺感染模型和HeLa细胞侵袭模型来试验筛选痢疾杆菌体内诱导基因的可行性。结果表明,以asd为报告基因,用HeLa细胞侵袭试验作为筛选模型,可成功地用于筛选痢疾杆菌的体内诱导基因。

子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

基于子囊霉素的生物合成途径和机制,根据生物合成基因簇序列设计引物,应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因,整合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌,命名为AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究,结果表明,与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工艺,AS-07工程菌与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了85%。

植物乳杆菌asd2基因的表达及其对多种氨基酸合成的促进作用

从植物乳杆菌WQ0815中克隆并表达天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd2,评估asd2表达对WQ0815中多种氨基酸合成的促进作用。结果表明,asd2大小为1 062 bp,编码354个氨基酸的蛋白质,具有保守的N端NAD结合域和C端二聚化结构域。利用乳酸菌表达载体p BEmp M4a构建了asd2表达工程菌株WQ0815-asd2;q RT-PCR结果表明,发酵4,7 h和10 h,重组菌株中asd2的转录水平分别是对照菌株的16,23倍和32倍。氨基酸含量检测结果表明,重组菌株中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的消耗速率明显小于对照菌株;发酵10h,重组菌株中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的含量约为对照菌株的1.5~2倍。研究表明,asd2的表达对植物乳杆菌WQ0815中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的合成具有显著促进作用。