大豆天冬氨酸途径关键酶基因GmASADH的克隆与分析

本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 130bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1(FJ581425)和GmASADH2(HM015631)。GmASADH1编码区长度为1 134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1 131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann super-family和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。

去天冬氨酸血管紧张素-1对人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的观察天冬氨酸血管紧张素-1(des-aspartate-angiotensin1,DAA-1)对过氧化氢致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。方法实验分为正常对照组,过氧化氢模型组,过氧化氢加DAA-1组(低剂量、中剂量、高剂量组)。倒置显微镜下观察细胞形态、密度。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,比色法测定细胞培养液中超氧化物歧化酶,活性、丙二醛及乳酸脱氢酶浓度。免疫细胞化学方法测定组织纤维蛋白溶酶原激活物,Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子表达量。逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定细胞内皮素1和血栓调节蛋白mRNA的表达。结果DAA-1能明显抑制过氧化氢所致的细胞活力的降低[0.443±0.024vs.0.317±0.024,P<0.01],减少细胞内乳酸脱氢酶释放[(102.35±9.87)U/Lvs.(242.78±16.10)U/L,P<0.01],提高超氧化物歧化酶活力[(19.10±2.33)U/mLvs.(8.16±3.48)U/mL,P<0.01],并呈剂量依赖性作用;能明显减少内皮细胞在氧化过程中丙二醛的生成[(1.35±0.19)U/mLvs.(2.33±0.48)U/mL,P<0.01],增加组织纤维蛋白溶酶原激活物蛋白表达,减少Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子蛋白表达;并能明显抑制内皮素mRNA的表达和提高血栓调节蛋白mRNA的表达。结论DAA-1对过氧化氢所致人脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。

lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA。摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8%。进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5%,较出发菌株分别提高29.5%和33.9%,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础。

痢疾杆菌体内诱导基因筛选方法的建立

分别用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)作为报告基因,用小鼠肺感染模型和HeLa细胞侵袭模型来试验筛选痢疾杆菌体内诱导基因的可行性。结果表明,以asd为报告基因,用HeLa细胞侵袭试验作为筛选模型,可成功地用于筛选痢疾杆菌的体内诱导基因。

小泛素样修饰蛋白特异性蛋白酶1介导糖尿病性血管内皮细胞损伤修复的研究

目的利用小泛素相关修饰体(SUMO)特异性蛋白酶1(SENP1)解离过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)的小泛素样修饰蛋白1(SUMO1)修饰。方法人脐静脉内皮细胞培养传代后分对照组、高糖组及SENP1组;Western blot法检测SENP1、SUMO1、PGC-1α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)水平;实时荧光定量PCR检测线粒体转录因子A(TFAM)、核呼吸因子2α(NRF-2α)和雌激素受体相关受体α(ERRα)的mRNA表达;ELISA测定乳酸脱氢酶(LDH);细胞划痕愈合方法、Transwell方法和体外血管模拟形成实验分别检测细胞自愈、迁移和形成血管拟态的能力。结果与对照组比较,高糖组共价SUMO1、PGC-1α和活化Caspase-3蛋白表达明显升高,SENP1蛋白表达明显降低,TFAM、NRF-2α和ERRα的mRNA表达明显降低,细胞划痕修复能力及模拟血管形成能力下降(P<0.05,P<0.01)。与高糖组比较,SENP1组SENP1蛋白表达明显升高,共价SUMO1、PGC-1α和活化Caspase-3蛋白表达明显降低,TFAM、NRF-2α和ERRα的mRNA表达明显升高,细胞划痕修复和迁移能力及模拟血管形成能力明显改善(P<0.05,P<0.01)。对照组、高糖组和SENP1组细胞上清液中LDH水平比较,差异有统计学意义[(24.66±6.39)ng/ml vs(302.45±30.54)ng/ml vs(174.08±21.03)ng/ml,P<0.01]。结论SENP1能够诱导PGC-1α发生去SUMO修饰,解除其对PGC-1α下游转录因子的抑制作用,改善线粒体功能,抑制高糖诱导的血管内皮细胞功能损伤作用。

口服齐墩果酸对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的研究口服齐墩果酸(OA)对D-氨基半乳糖诱导小鼠急性肝损伤的保护作用。方法将♂昆明种小鼠随机分为对照组、OA给药组、模型组、OA预处理组。采用ig给予OA给药组和OA预处理组小鼠200μmol·kg-1OA,ig给予对照组、模型组等体积菜籽油,每天2次,连续3 d,末次给药1 h后,ip给予对照组、OA给药组等体积生理盐水,ip给予模型组和OA预处理组800 mg·kg-1D-氨基半乳糖溶液造模,造模8 h后,收集各组小鼠的血液和肝脏组织,测定小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝脏中丙二醛(MDA)的含量,观察肝组织病理学的改变,并应用实时定量RT-PCR检测肝毒性相关基因的表达水平。结果 OA预处理能降低D-氨基半乳糖所致小鼠血清中AST、ALT的活性及肝组织中MDA的含量,明显改善肝细胞坏死病变的程度,并逆转小鼠急性肝损伤所致的生长停滞及DNA损伤诱导基因153(Chop10)、生长停滞及DNA损伤诱导基因45、Egr1、m KC、TNF-αm RNA表达的增高。结论 OA对D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤具有保护作用,其机制可能与缓解急性内质网应激、减轻炎症和抗氧化有关。

植物乳杆菌asd2基因的表达及其对多种氨基酸合成的促进作用

从植物乳杆菌WQ0815中克隆并表达天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd2,评估asd2表达对WQ0815中多种氨基酸合成的促进作用。结果表明,asd2大小为1 062 bp,编码354个氨基酸的蛋白质,具有保守的N端NAD结合域和C端二聚化结构域。利用乳酸菌表达载体p BEmp M4a构建了asd2表达工程菌株WQ0815-asd2;q RT-PCR结果表明,发酵4,7 h和10 h,重组菌株中asd2的转录水平分别是对照菌株的16,23倍和32倍。氨基酸含量检测结果表明,重组菌株中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的消耗速率明显小于对照菌株;发酵10h,重组菌株中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的含量约为对照菌株的1.5~2倍。研究表明,asd2的表达对植物乳杆菌WQ0815中赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸的合成具有显著促进作用。

归术活血胶囊对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

目的:探讨归术活血胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:建立大鼠大脑动脉栓塞模型,随机将大鼠分为模型组、尼莫地平阳性对照组及归术活血胶囊高、中、低剂量组,另设假手术组。各组灌胃给予水或相应药物,将皮层及海马组织分为损伤侧与对照侧,测定两侧天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LD)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量或活性,并以红四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死面积,以烘干法测定脑含水量。结果:与模型组比较,归术活血胶囊组(其中一组或几组)皮层Asp含量无明显变化,而海马组织损伤侧Glu含量明显降低(P<0·05),皮层损伤侧TNF-α含量明显增加(P<0·05),皮层及海马组织两侧MDA含量和GSH-Px活性显著降低(P<0·05),皮层损伤侧LD含量轻微升高,对照侧LD含量明显下降(P<0·05),皮层两侧K+-Na+-ATP酶活性降低(P<0·05),脑含水量降低且脑梗死面积明显减小(P<0·05)。结论:归术活血胶囊对模型大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

皂荚皂苷对大鼠心肌缺血的影响

目的:研究皂荚皂苷对大鼠急性心肌缺血的防治作用。方法:采用结扎大鼠左冠状动脉的方法,造成急性心肌缺血模型,通过对大鼠标准Ⅱ导联心电图,心肌梗死面积及血清中天冬氨酸转氧酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定,探讨皂荚皂苷对大鼠心肌缺血的影响。结果:皂荚皂苷25,50,100 mg·kg-13个剂量组大鼠预防性灌胃给药5 d,与模型组比较,都不周程度降低心电图标准Ⅱ导联ST段抬高幅度(P<0．05,P<0．01):皂荚皂苷25,50,100 mg·kg-1剂量组的心肌梗死面积分别为(28±s 8)％,(24±10)％和(19±6)％,均显著小于模型组大鼠[(38±9)％,P<0．05．P< 0．01];模型组大鼠的血清AST,CK,LDH活力明显高于假手术组(P<0．01),而升高的酶活力可以被预先给予各给药剂量的皂荚皂苷所降低(P<0．05,P<0．01);与模型组比较,增加了血清中SOD活性及降低血清中 MDA含量(P<0．05,P<0．01)。结论:皂荚皂苷对结扎大鼠左冠状动脉造成的急性心肌缺血有显著的防治作用。

子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化

基于子囊霉素的生物合成途径和机制,根据生物合成基因簇序列设计引物,应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因,整合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌,命名为AS-07。将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究,结果表明,与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了25%。通过初步优化摇瓶发酵工艺,AS-07工程菌与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了85%。

二苯乙烯苷、大黄素改善高糖诱导下小鼠海马神经元凋亡

目的探讨何首乌主要成分二苯乙烯苷(TSG)、大黄素(Emodin)对高糖诱导下海马神经元HT-22细胞凋亡的影响。方法将小鼠海马神经元HT-22细胞分为4组:对照培养基组(NC组,葡萄糖浓度25 mmol/L)、高糖培养基组(HG组,葡萄糖浓度55 mmol/L)、HG+TSG组和HG+Emodin组。HG+TSG组和HG+Emodin组分别用TSG和Emodin以50、100、200μmol/L的浓度作用细胞12、16、20、24、48 h,CCK-8法检测细胞存活率,确定细胞的最佳作用浓度和时间。流式细胞术检测细胞凋亡率;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测4组细胞组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性;蛋白免疫印迹(Western blot)检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果TSG以200μmol/L、48 h,Emodin以100μmol/L、48 h作用细胞为最适条件。流式细胞术结果显示,TSG和Emodin干预细胞48 h后,细胞凋亡率显著降低。ELISA结果显示,HG+TSG组的HAT活性显著下调,HDAC活性上调;HG+Emodin组的HAT和HDAC活性显著下调。Western blot结果显示,TSG和Emodin作用细胞48 h后,Bax和Caspase-3的表达显著下调,Bcl-2的表达显著上调。结论TSG和Emodin可能通过调节HAT和HDAC活性,从而改善在高糖诱导下的海马神经元细胞凋亡。

槲皮素预处理高糖环境培养的人脐静脉内皮细胞氧化应激、内质网应激反应观察

目的观察不同浓度槲皮素预处理后高糖培养条件培养的人脐静脉内皮细胞、氧化应激、内质网应激情况,并探讨其可能作用机制。方法体外培养内皮细胞,分为槲皮素组(Q20组、Q50组及Q100组)、高糖组(HG组)及正常对照组(Control组),Q20组预先加入20μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞,Q50组预先加入50μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞,Q100组预先加入100μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞。HG组在培养液中加入10 mg/L的HG培养细胞,Control组采用低糖DMEM培养基培养。干预24 h时采用CCK-8法观察各组细胞活性;培养24 h时采用流式细胞术测算内皮细胞凋亡率及细胞活性氧簇(ROS)含量,采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定内皮细胞细胞培养液中LDH活性,采用WesternBlotting法检测各组内皮细胞内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase 12)。结果与Control组比较,培养24 h时HG组内皮细胞活性下降(P<0.05);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组内皮细胞活性增加(P均<0.05),且随浓度增加,细胞活性上升(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞凋亡率增加(P<0.05);与HG组比较,培养24 h时Q20组、Q50组及Q100组细胞凋亡率降低,且随槲皮素浓度增加,细胞凋亡率下降(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞ROS含量升高(P<0.05);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组细胞ROS含量降低,且随槲皮素浓度增加,ROS含量降低(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞培养液中LDH活性升高(P<0.05);与HG组比较,Q50组及Q100组细胞培养液中LDH活性降低(P均<0.05);与Q50组比较,Q100组细胞培养液中LDH活性降低(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组内皮细胞GRP78、CHOP、Caspase 12表达升高(P均<0.01);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组内皮细胞GRP78、CHOP、Caspase 12表达量降低(P均<0.01)。结论槲皮素预处理能提高高糖培养液中的内皮细胞活性,降低细胞培养液中LDH活性,抑制细胞凋亡,降低ROS含量,抑制细胞GRP78、CHOP及Caspase 12表达,且随着浓度的增加,其抑制作用增强。槲皮素可能通过抑制高糖条件下内皮细胞的氧化应激和内质网应激反应,抑制内皮细胞的凋亡,发挥内皮细胞保护作用。

环状RNA在缺氧/复氧诱导的大鼠H9c2细胞焦亡中的作用及其机制

目的探讨环状RNA(circRNA)在缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠心肌细胞焦亡中的作用及其机制。方法将大鼠心肌细胞H9c2分为A~F组,分别进行缺氧0、1、3、6、12、24 h处理后,再进行6 h复氧,采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒及Western blot方法检测H/R处理的H9c2细胞上清液中LDH活性和焦亡相关蛋白表达水平,确定诱导H9c2细胞焦亡的最佳缺氧时间。将H9c2细胞分为对照组和实验组,对照组H9c2细胞置于细胞培养箱中培养12 h,实验组H9c2细胞置于厌氧培养箱进行H/R处理,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测两组H9c2细胞中circRNA的表达水平。将H9c2细胞分为G~I组,G组H9c2细胞置于细胞培养箱中培养12 h,H组转染对照siRNA(NC),I组转染mmu_circ_0000723特异性siRNA(siRNA-mmu_circ_0000723)。转染24 h后,采用RT-qPCR方法检测各组H9c2细胞中mmu_circ_0000723的表达水平。将H9c2细胞分为J~M组,J组H9c2细胞置于细胞培养箱中培养12 h,K组H9c2细胞置于厌氧培养箱进行H/R处理,L组和M组H9c2细胞分别转染对照NC和siRNA-mmu_circ_0000723,并于转染24 h后进行H/R处理。分别采用碘化丙啶(PI)染色、LDH试剂盒和Western blot方法检测J~M组的PI阳性细胞比率、细胞上清液中LDH活性,以及焦亡相关蛋白的表达水平。结果A~F组H9c2细胞上清液中LDH活性和焦亡相关蛋白的表达水平差异有显著性(F=24.86~2153.00,P<0.05)。与A组相比,D组H9c2细胞中LDH活性及焦亡相关蛋白的表达显著性差异最明显(t=4.14~62.88,P<0.05)。与对照组相比,实验组H9c2细胞中mmu_circ_0000723的表达水平明显降低(t=9.78,P<0.05)。G~I组H9c2细胞中mmu_circ_0000723的表达差异有显著性(F=348.20,P<0.05);与G组相比,I组H9c2细胞中mmu_circ_0000723相对表达水平显著降低(t=22.88,P<0.05)。J~M组PI阳性细胞比例、细胞上清液中LDH活性和焦亡相关蛋白的表达水平差异均有显著性(F=34.39~8528.00,P<0.05);与K组相比,M组H9c2细胞上述5个指标均明显升高(t=4.99~54.00,P<0.05),而L组细胞上述5个指标差异无显著性(P>0.05)。结论mmu_circ_0000723通过调控焦亡相关蛋白的表达,在H/R诱发的H9c2细胞焦亡中发挥重要作用。

本刊常用的缩略语（八）

三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde three phosphate dehydrogenase，GAPDH） 天冬氨酸转氨酶（aspartate＋aminotransferase，AST）

本刊可直接使用英文缩写的常用词汇

已被公知公认的缩略语如DNA、RNA、HbsAg、CT、Ig、PCR,可不加注释直接使用。以下词汇也允许直接使用英文缩写。腺苷三磷酸（ATP）集落形成单位（CFU）细胞外基质（ECM）酶联免疫吸附测定（ELISA）成纤维细胞（Fb）胎牛血清（FBS）丙氨酸转氨酶（ALT）天冬氨酸转氨酶（AST）3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）血红蛋白（Hb）重症监护病房（ICU）

周期型马来丝虫复合基因重组质粒和相应表达蛋白的免疫学研究

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂／3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmcPI／，BmGAPDH）复合基因重组质粒，并转染人宫颈癌细胞（Hela）进行重组蛋白表达。将重组质粒和相应表达蛋白进行免疫学研究比较。为研制新型的抗丝虫基因工程疫苗提供理论及实验依据。方法扩增周期型马来丝虫目的编码基因。将目的基因片段和载体分别双酶切后进行连接，构建复合基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI/BmGAPDH，鉴定后转染Hela细胞，以G418筛选转染细胞，进而通过RT-PCR和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。亲和层析纯化所表达的重组蛋白并通过免疫蛋白印迹法（Westernblot）对纯化的重组蛋白进行生物学鉴定。60只BALB／c小鼠分5组，每组12只，第2、4、6周分别免疫1次。磷酸盐缓冲液（PBS）对照组为注射PBS100μl；空质粒／CpG对照组为注射pcDNA3．1100μg和CpG30μg；复合重组质粒／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μ；复合重组蛋白／CpG组为注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50P-g和CpG30μg；复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组前2次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH100μg和CpG30μg；后1次注射pcDNA3．1-BmCPI／BmGAPDH复合重组蛋白50μ和CpG30μg。用RT—PCR方法检测肌肉组织内目的基因；用酶联免疫吸附试验（ELISA）、特异性增殖试验（MTT法）分别检测免疫小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子干扰素（INF）-γ、白细胞介素（IL）-4水平。结果复合重组质粒pcDNA3．1（＋）-BmCPI／BmGAPDH免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织扩增出目的基因。复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组小鼠免疫4、6周后血清抗体效价（1695．12±1．43、3199．63±1．34）均高于复合重组质粒／CpG组（712．69±1．08、1510．08±1．43，P均〈0．05）和复合重组蛋白／CpG组（800．02±1．34、1510．08±1．43，P均〈0．05）；第6周的复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数（1．629±0．235）高于复合重组蛋白组（1．248±0．110，P〈0．05）；免疫4、6周后，复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组和复合重组质粒／CpG组小鼠血清IFN-γ水平[（101．660±5．101）、（178．265±7．139）mg／L，（102．067±3．722）、（115．148±6．031）mg／L]均高于复合重组蛋白组[（75．438±2．102）、（82．004±3．777）mg／L，P均〈0．05]；免疫后6周，复合重组质粒／复合重组蛋白／CpG组和复合重组蛋白／CpG组的小鼠血清IL-4水平[（75．385±3．318）、（46．363±3．672）mg／L]均明显高于复合重组质粒／CpG组[（36．691±3．443）mg／L，P均〈0．05）。结论pcDNA3．1-BmCPL／BmGAPDH核酸疫苗和相应蛋白疫苗均可诱导BALB／c小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答反应。核酸疫苗-蛋白疫苗联合免疫效果有明显的优势。

周期型马来丝虫复合表位基因的构建及在真核细胞中的表达

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法根据T细胞表位预测的基因序列设计引物,以质粒pGEM-T-CPI621为模版,利用反转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)-BmCPI502。根据软件设计合适引物,RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因,pcDNA3.1(+)、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接,构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后,进行RT-PCR验证,获得与预期相符目的条带;将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果获得了原核表达重组质粒pET28a(+)-BmCPI502,经酶切鉴定得到502 bp特异性片段,与预期值符合;成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合;复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达,SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr×10^(3))约为50。结论成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并在真核细胞中获得相应的重组蛋白,为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

载葛根素的PEG修饰介孔硅纳米粒的制备及其对急性心肌缺血大鼠的保护作用

目的制备载葛根素的PEG修饰介孔硅纳米粒(PUE@PEG-MSNs),评价其对急性心肌缺血的保护作用。方法通过缩合反应制备PEG-MSNs,再负载葛根素(PUE),并通过粒径、Zeta电位、透射电子显微镜(TEM)和傅里叶转换红外线光谱(FTIR)等检测表征PUE@PEG-MSNs,采用HPLC测定其载药量和包封率;采用结扎冠状动脉制备60只急性心肌缺血模型大鼠,随机分成6组,每组10只,分别为假手术组、模型组、PUE注射液组和PUE@PEG-MSNs高、中、低剂量组,在结扎后5 min各给药组尾iv给药。监测心电图ST段变化,测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙二醛(MDA)水平,并测量心肌梗死面积。结果 PUE@PEG-MSNs呈规则圆球形,大小均一,粒径约300 nm,电势约-30 m V,且可以负载PUE,载药量和包封率分别为14.7%和67.8%。PUE注射液和PUE@PEG-MSNs均能降低升高的ST段,降低血清中CK、LDH、AST和MDA水平,减少心肌梗死面积;其中PUE@PEG-MSNs中、高剂量组的药效明显强于PUE注射液组。结论 PUE@PEG-MSNs制备成功,对急性心肌缺血大鼠具有良好的保护作用。

纳米氧化锌诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549发生炎性凋亡的研究

目的用纳米氧化锌(ZnO-NPs)刺激体外培养的人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549),探讨其是否发生炎性凋亡。方法用10μg/ml和20μg/ml的ZnO-NPs分别刺激A549细胞8和24h,以磷酸盐缓冲液(PBS)为对照,用乳酸脱氢酶(LDH)活力测定试剂盒和白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒分别检测细胞培养上清液中的LDH酶活力和IL-1β含量,用半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(caspase-1)活性测定试剂盒检测细胞caspase-1的活性。结果纳米氧化锌作用于A549细胞8h,染毒组和对照组LDH酶活力差异无显著性,与对照组比较,20μg/ml ZnO-NPs染毒组caspase-1活性和IL-1β含量均升高(P<0.05)。ZnO-NPs作用于A549细胞24h时,染毒组和对照组caspase-1活性差异无显著性。染毒组IL-1β含量和LDH酶活力均显著高于对照组(P<0.05)。结论纳米氧化锌(20μg/ml)刺激A549细胞早期caspase-1活性升高,继之IL-1β含量和LDH酶活力升高,可能发生了炎性凋亡。