依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的肝细胞凋亡在肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用

目的 :探讨肝硬化大鼠肝缺血 /再灌注 (I/R)损伤是否与肝细胞凋亡相关及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 - 3(caspase- 3)活性变化与肝细胞凋亡的关系。方法 :Pringle法复制肝I/R模型 ,将肝硬化大鼠随机分为 2组 :A组 :单纯肝门阻断 ;B组 :血流阻断 +抑制剂 :N -苯甲基氧化碳酰 -缬氨酸 -丙氨酸 -天冬氨酸 -氟化丙酮(ZVAD -fmk) 15mg/kg ;取无肝硬化大鼠 ,作单纯肝门阻断为C组。各组肝门阻断时间均为 30min ,再灌注 72h。比较 3组的血清天冬氨酸转氨酶 (AST)、肝组织的caspase - 3活性和肝细胞凋亡数。结果 :A组大鼠肝组织caspase - 3活性、肝细胞凋亡数在再灌注后 6h达高峰 ,分别为 (18 1± 1 8) μmolAMC·h-1·g-1(tissue)和 2 0 9%± 4 9% ,与I/R前的 (6 6± 2 0 ) μmolAMC·h-1·g-1(tissue)和 0 5 %± 0 3%相比 ,P <0 0 1。肝细胞凋亡数、caspase - 3的活性随灌注时间的延长而减低 ,两者随时间的变化一致。 3组中A组肝损伤最严重 ,表现为再灌注后 6h血清AST最高 ,与B、C组比较有显著差异 ,大鼠 7d生存率只为 6 2 5 %。进一步研究表明 ,再灌注后 6h ,A组的肝组织caspase - 3活性、肝细胞凋亡数亦明显比B、C组高。结论 :肝细胞凋亡是肝硬化大鼠肝I/R损伤的主要病理改变。

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3／9活性改变及其与凋亡的关系

目的探讨脓毒症时CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3／9（caspase-3／9）活性变化及其与激活诱导细胞凋亡的关系。方法体外培养免疫磁珠法分选大鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg，随机分为对照组、抗CD3／CD28组、抗CD3／CD28＋脂多糖（LPS）组，培养3d后采用流式细胞术检测Treg凋亡率，荧光比色法检测caspase-3／9活性。同时采用盲肠结穿孔术（CLP）复制大鼠脓毒症模型，将动物随机分为正常对照组、假手术组、CLP组，于第3日分离Treg后检测Treg凋亡率和caspase-3／9活性。结果体外实验显示，抗CD3／CD28组和抗CD3／CD28＋LPS组CD4^＋CD25^＋Treg凋亡率均显著高于对照组（P均〈0．01），而抗CD3／CD28＋LPS组Treg凋亡率明显低于抗CD3／CD28组（P〈0．05）。抗CD3／CD28组caspase-3／9活性均显著高于对照组（P均〈0．01）；抗CD3／CD28＋LPS组caspase-3／9活性则明显低于抗CD3／CD28组（P均〈0．01）。体内实验显示，CLP组CD4^＋CD25^＋Treg凋亡率和caspase-3活性均显著低于正常对照组和假手术组（P均〈0．01），但caspase-9活性改变不明显（P均〉0．05）。结论脓毒症病理过程中CD4^＋CD25^＋Treg凋亡率明显下降，caspase-3激活是诱发Treg凋亡的重要途径之一。

银杏叶提取物对惊厥性脑损伤大鼠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响及意义

目的探讨天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在惊厥性脑损伤发病机制中的作用及银杏叶提取物对脑损伤的可能保护机制。方法将20日龄健康SD大鼠108只随机分为3组:对照组、惊厥组及银杏叶提取物干预组。通过三氟乙醚反复吸入制备大鼠惊厥模型。干预组在每次惊厥后立即腹腔注射银杏叶提取物50 mg/kg,12 h后再重复注射1次,其他两组注射等量生理盐水。各组动物于末次惊厥后1、3和7 d采用免疫组化法检测海马组织中caspase-3蛋白表达,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测海马组织中caspase-3 mRNA表达。结果末次惊厥后1、3和7 d海马caspase-3的蛋白及mRNA表达均较对照组显著升高,3 d时达峰值(P均<0.01)。银杏叶提取物干预组各时间点海马caspase-3的蛋白及mRNA表达均较惊厥组显著下调(P<0.05或P<0.01)。结论大鼠反复惊厥后海马caspase-3表达显著增高,提示caspase-3参与了惊厥性脑损伤的病理过程。银杏叶提取物能下调惊厥后海马caspase-3的异常表达,提示其对惊厥性脑损伤的保护机制可能与抑制海马caspase-3异常表达有关。

葛根素对缺血/再灌注损伤兔肺组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3变化的影响

目的探讨天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在兔肺缺血/再灌注损伤(LIRI)中的变化及葛根素的保护作用机制。方法健康日本大耳白兔30只,随机分为对照组、缺血/再灌注(I/R)组及葛根素组,每组10只。复制单侧LIRI模型。对比观察各组血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、肺湿/干重(W/D)比值及肺泡损伤指数(IQA);用原位末端缺刻标记法(TUNEL)测定肺组织细胞凋亡指数(AI);用免疫组化及原位杂交技术分别检测肺组织caspase-3蛋白和mRNA表达。结果与对照组比较,I/R组血清SOD活性和NO含量降低,MDA含量、W/D比值、IQA、AI值及caspase-3表达均上调(P均<0.01)。与I/R组比较,葛根素组SOD、NO显著升高,MDA、W/D比值、IQA、AI值及caspase-3表达明显下降(P均<0.01)。相关分析显示:AI值与SOD、NO呈明显负相关,与MDA、caspase-3 mRNA及caspase-3蛋白呈明显正相关(P均<0.01);caspase-3 mRNA与SOD、NO呈明显负相关,与MDA含量呈明显正相关(P均<0.01)。结论葛根素可通过提高体内NO水平、降低氧自由基水平、减轻脂质过氧化反应,下调caspase-3的mRNA和蛋白表达,从而抑制肺再灌注后肺组织细胞的异常凋亡,减轻LIRI。

肺缺血再灌注损伤模型大鼠肺组织细胞凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达的动态变化(英文)

背景:肺缺血再灌注损伤过程中肺组织细胞凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达的动态变化及其可能的作用机制有待观察。目的:观察大鼠肺缺血再灌注损伤中肺组织细胞凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达的动态变化,并分析细胞凋亡在肺缺血再灌注损伤中作用及可能机制。设计:随机对照动物实验。单位:南京医科大学附属南京第一医院急诊中心。材料:实验于2006-04/2006-09在南京医科大学附属南京第一医院动物实验室及南京市放射免疫检测中心完成。选用28只雄性健康清洁级SD大鼠,体质量250￣350g,鼠龄49￣76d,由南京医科大学实验动物中心提供。随机数字表法将大鼠分为实验组及对照组,每组14只。方法:①实验干预:实验组大鼠参照Eppinger等的方法进行建立肺缺血再灌注模型,大鼠给予阻断肺门45min(观察肺无舒缩为阻断标准),再开放3,6h(再灌注以肺恢复舒缩为标准)后取材,每次取7只,对照组仪行开胸术,于相同时间点同样方法分离肺组织。②实验评估:采用Annexin-V-PI双染法通过流式细胞仪检测肺组织凋亡细胞,计算凋亡率;采用免疫组织化学法及图像分析法观察肺脏天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达;计算2组大鼠左肺湿干质量比;计算肺泡损伤数比值进行肺组织损伤定量评价;光镜下苏木精-伊红染色观察肺脏的病理形态学变化。主要观察指标:①肺组织细胞凋亡率及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达。②肺湿干质量比及肺组织损伤定量评价结果。③肺组织病理形态学变化。结果:纳入大鼠28只均进入结果分析,无脱落。①实验组肺缺血再灌注3,6h肺组织细胞凋亡率较对照组有明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),实验组缺血再灌注6h凋亡率较3h有所降低(P<0.05)。②实验组大鼠肺组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达3h达到最高,6h稍有下降,较对照组各时间点表达增加(P<0.01)。③实验组肺缺血再灌注3,6h肺泡损伤数比值及肺脏湿干质量比值较对照组均明显增加(P<0.01),实验组缺血再灌注6h两比值较3h有所增加(P<0.05)。④实验组肺泡结构破坏、塌陷、消失,肺泡间隔有大量的炎性细胞浸润,肺缺血再灌注6h较3h更严重。对照组无明显改变。结论:肺缺血再灌注早期可能通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达的改变,激活细胞的凋亡途径,诱导肺组织细胞凋亡的发生,从而导致肺损伤的发生。

三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8表达的影响

目的 研究三磷酸腺苷敏感性钾通道(KATP)开放剂对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8 表达的影响.方法 200只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、对照组、KATP开放剂预处理组(开放剂组)及KATP开放剂+阻断剂预处理组(阻断剂组).应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,应用原位末端标记法(TUNEL)、免疫组化染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测脑缺血再灌注后各组脑组织凋亡细胞数和caspase-8 mRNA及蛋白的表达.结果 (1)缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点凋亡细胞数,开放剂组较对照组和阻断剂组显著减少(P＜0.05～0.01),阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义.(2)缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h各时间点caspase-8蛋白表达,开放剂组显著低于对照组和阻断剂组(P＜0.05～0.01),阻断剂组与对照组间各时间点差异无统计学意义.(3)缺血再灌注各时间点caspase-8 mRNA表达,开放剂组均显著低于对照组和阻断剂组(均P＜0.01), 阻断剂组与对照组各时间点相比差异无统计学意义.结论 KATP开放剂能显著减少脑缺血再灌注后神经元凋亡和caspase-8 mRNA及蛋白的表达;KATP开放剂可能通过抑制死亡受体通路发挥脑保护作用.

糖尿病大鼠血蛋白激酶C和骨骼肌Bax/B细胞淋巴瘤-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3变化及其意义

目的:探讨糖尿病大鼠血蛋白激酶C(PKC)和骨骼肌Bax/Bcl-2、Caspase3变化及意义。方法:建立糖尿病大鼠模型,16只SD大鼠随机分成正常对照组和糖尿病组,采用ELISA法测定血PKC值,取后肢腓肠肌HE染色后行组织学观察,并用免疫组化方法测定Bax、Bcl2和Caspase3值。结果:糖尿病组大鼠骨骼肌普遍萎缩,肌纤维萎缩变细,纤维变性、水肿,部分区域坏死,纤维断裂,肌丝走行紊乱,核固缩,横纹模糊消失,间质脂肪组织略增生。糖尿病组和正常对照组大鼠的血PKC值分别为110.60±5.94ng·mL-1和74.72±7.19ng·mL-1,骨骼肌Bax值分别为26311±3698.30μm2和16764±6116.10μm2,Bcl2值分别为18573±8529.90μm2和35533±485.52μm2,Caspase3值为32419±3201.50μm2和12123±1919.60μm2。糖尿病大鼠血中PKC值较正常对照组显著升高,糖尿病组肌肉中Caspase3及Bax值显著升高,而Bcl2值明显下降,Bax/Bcl2值升高,两组间比较均有显著差异。结论:氧化应激中的PKC途径及细胞凋亡通路共同参与了糖尿病骨骼肌病变的发生,可能是糖尿病骨骼肌病变的重要发病机制之一。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3mRNA在人脑挫裂伤后神经细胞中的表达

目的研究天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3mRNA在脑挫裂伤患者神经细胞中的表达与预后的关系。方法应用原位杂交技术检测脑组织15例Caspase-3mRNA的表达情况。结果均有不同程度的Caspase-3mRNA表达,死亡组表达值较存活组明显升高。两组之间表达差异有显著性意义。结论脑挫裂伤后Caspase-3mRNA表达程度较高,Caspase-3mRNA过度表达在脑挫裂伤后神经细胞凋亡的调控中起一定的作用。

星形胶质细胞对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶介导β淀粉样蛋白早期突触毒性作用的影响

目的探讨星形胶质细胞(astrocyte,AS)对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)介导β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)早期突触毒性作用的影响,以期为进一步研究与血管性痴呆(vascular dementia,Va D)的发病机制奠定基础。方法以原代培养大鼠海马纯神经元体系(NE-S)及混合培养体系(MIX-S,主要包含神经元及AS)为研究对象,各体系分为6组:对照组、caspase-8抑制剂组、caspase-9抑制剂组、Aβ处理组、caspase-8抑制剂预处理加Aβ组和caspase-9抑制剂预处理加Aβ组。免疫荧光检测各组近胞体10μm段树突中突触后密度蛋白(postsynaptic density-95,PSD95)表达量的变化。结果 1在NE-S与MIX-S中,与对照组相比,caspase-8抑制剂组、caspase-9抑制剂组PSD95的表达量均无明显差异,Aβ处理组PSD95的表达量均显著降低(P均<0.001)。2在NE-S中,与Aβ处理组相比,caspase-9抑制剂预处理加Aβ组PSD95的表达量显著回升至对照组水平,caspase-8抑制剂预处理加Aβ组则无显著改变;在MIX-S中的结果则相反,即caspase-8抑制剂预处理加Aβ组PSD95的表达量显著回升至对照组水平,而caspase-9抑制剂预处理加Aβ组则无显著改变。3MIX-S与NE-S两种培养系统间相比较,对照组间及Aβ处理组间PSD95的表达量均无显著差异,而caspase-8抑制剂预处理加Aβ组间及caspase-9抑制剂预处理加Aβ组间PSD95的表达量差异有显著性。结论在Aβ早期突触毒性作用中,AS参与caspase-8介导的死亡受体通路激活过程,且参与抑制神经元的线粒体通路。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化在喜树碱诱导膀胱癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活化,在DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂喜树碱(CPT)诱导人膀胱癌细胞凋亡中的作用。方法:将体外培养的膀胱癌RT4 和MGH细胞用CPT处理,用流式细胞仪检测处理前及处理后24、36、48h等不同时段细胞凋亡的变化,用蛋白免疫印迹方法检测CPT处理后不同时间段caspase -9和caspase -3活性的改变。结果:CPT处理膀胱RT4 和MGH细胞后,细胞凋亡率明显上升,且CPT诱导的膀胱癌凋亡呈时间依赖性和剂量依赖性。同时还可以观察到凋亡执行蛋白caspase-9和caspase -3 的活化。结论:CPT能够诱导膀胱癌细胞RT4和MGH发生凋亡,其中caspase -9启动的凋亡内源性途径即线粒体途径可能参与了CPT诱导的膀胱癌细胞的凋亡。

黄芪和红花对脑缺血再灌注后大鼠神经细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的影响

目的研究黄芪和红花对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的影响。方法采用局灶性脑缺血再灌注模型,分假手术组、模型组、黄芪加红花组、黄芪组和红花组。术后分为12h、24h和48h3个时间点,行神经功能评分;缺口末端标记法观察凋亡的情况;免疫组织化学观察缺血周围区神经细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8表达强度。结果黄芪和红花均能改善大鼠脑缺血再灌注后的神经功能评分。缺血再灌注24h的凋亡阳性细胞数与模型组比较,各治疗组差异均有显著性(P<0.05);在治疗组中,黄芪加红花组与红花组和黄芪组凋亡阳性细胞数比较差异均有显著性(P<0.05)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8阳性表达水平:缺血再灌注12h,黄芪组、黄芪加红花组与模型组比较,差异均有显著性(P<0.05);红花组与黄芪加红花组比较,差异均有显著性(P<0.05)。缺血再灌注24h和缺血再灌注48h,各组之间差异有显著性(P<0.05)。结论黄芪加红花可减轻大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制可能与下调凋亡通路中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8的表达有关。

肿瘤坏死因子-α与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3在大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤中的作用

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)肺损伤中的作用及意义。方法:大鼠胰腺被膜下均匀注射质量分数5%的牛磺胆酸钠建立ANP动物模型。建模后12、24和48 h检测肺组织TNF-α水平和Caspase-3蛋白表达水平,同时观察肺组织病理改变并给予常规病理评分。结果:大鼠肺组织TNF-α水平和Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01),肺组织呈现典型炎性损伤性改变,常规病理评分升高(P<0.01)。结论:TNF-α和Caspase-3可能参与了大鼠ANP肺损伤,其水平的高低与ANP肺损伤严重程度密切相关。

热休克预处理抑制过氧化氢所致C2C12肌原细胞释放天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物及细胞凋亡

为探讨热休克预处理对过氧化氢所致C2C12肌原细胞凋亡和第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物从线粒体释放的影响 ,采用 0 .5mmol L过氧化氢作用于C2C12肌原细胞。Hoechst332 5 8荧光染色 ,观察细胞形态学改变并计算凋亡百分率 ,抽提DNA作琼脂糖电泳 ,以确定细胞凋亡情况。采用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性定量检测试剂盒及蛋白质印迹观察天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 9的活化情况。采用免疫荧光及细胞成分分离后蛋白质印迹检测第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物从线粒体的释放。结果发现 ,过氧化氢处理 1～ 2h ,第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物逐渐从线粒体释放入胞浆 ;处理 4h天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 9活性升高 ,12h达高峰 ;处理 2 4h细胞明显出现凋亡 ,凋亡百分率明显升高。热休克预处理可诱导C2C12肌原细胞中热休克蛋白 90 ,热休克蛋白 70及αB 晶状体蛋白的表达增高 ;抑制第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物释放、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 9的活化及细胞凋亡的发生。结果提示 ,线粒体信号通路在?

补阳还五汤对脑梗死患者天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3影响的研究

目的探讨补阳还五汤对脑梗死患者天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的影响。方法选择2007年12月至2009年12月60例脑梗死患者，随机分为中西医结合治疗组（32例）和常规西医对照组（28例）。两组均给予常规西医治疗，治疗组加用补阳还五汤（黄芪60g，当归20g，地龙15g，赤芍10g，红花10g，川芎10g，桃仁6g），每日1剂，两组疗效均为2周。治疗前和治疗2周后观察两组患者脑脊液caspase-3变化、脑水肿体积以及症状、体征改善情况。结果中西医结合组治疗后脑脊液caspase-3[（3．4±1．7）U／L]、脑水肿体积[（2．4±1．3）ml]均明显低于对照组[（6．8±1．5）U／L、（3．8±1．3）ml，均P〈0．01]，临床总有效率（93．8％）明显优于对照组（75．0％，P〈0．01）。结论补阳还五汤有助于减轻脑水肿，提高临床疗效，是脑梗死的理想用药之一。

气体冲击致豚鼠耳蜗损伤后天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达

目的:观察气体冲击致豚鼠耳蜗损伤后天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达。方法:实验于2005-01/06在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择健康白色红目豚鼠20只,随机分为正常对照组和气体冲击致伤组,各10只。实验组用30kPa压力气体冲击致伤豚鼠耳蜗,冲击20次,间隔20s/次;正常对照组不进行气体冲击致伤。实验前后测试听性脑干反应阈值,冲击波暴露后12h处死动物制作耳蜗标本。免疫组化法测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达。结果:纳入豚鼠20只,均进入结果分析。①实验组听性脑干反应阈值较正常对照组明显上升[(50.94±5.98),(5.60±1.78)dBnHL,t=22.98,P<0.01],听力下降明显。②免疫组织化学染色结果显示实验组豚鼠耳蜗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3反应阳性,柯蒂氏器及血管纹、螺旋神经节细胞的细胞质内有染色程度不同的棕黄色颗粒分布,染色阳性细胞数以血管纹、螺旋神经节细胞较多,愈近底回愈多,愈近顶回则愈少。对照组无阳性表达。结论:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3在气体冲击致豚鼠耳蜗损伤后呈阳性表达,提示耳蜗细胞凋亡在冲击波致聋的发病机制中起重要作用。

类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中白藜芦醇的诱导作用及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化

目的:探讨来自植物中的天然活性成分白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中,凋亡执行因子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活化状态及其参与作用,并分析其浓度与时间作用。方法:实验于2003-05/10在中南大学湘雅二医院中心实验室完成。人类风湿关节炎滑膜组织取自中南大学湘雅二医院骨科2003-05诊治的1例男性50岁患者。①将手术切取的滑膜组织,剔除脂肪及纤维组织后经清洗、剪碎、消化、离心、培养、传代,获得3-5代细胞,电子显微镜观察滑膜细胞生长过程中的形态变化。②将细胞分为3组,对照组(未用药处理的滑膜细胞);白藜芦醇组(50,100,200,400μmol/L白藜芦醇处理12h的细胞及用200μmol/L白藜芦醇处理4,8,12,18,24h的细胞);天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂+白藜芦醇组(先用1mmol/L天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抑制剂预处理2h,再用白藜芦醇处理的滑膜细胞),各组均设3复管。③比色法测定用200μmol/L白藜芦醇处理后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性;不同浓度的白藜芦醇处理12h后的类风湿关节炎滑膜细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性。④采用Western-blot分析不同浓度白藜芦醇处理24h的类风湿关节炎滑膜细胞,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的裂解。⑤实验设计为分组匹配对照。结果:①滑膜细胞培养过程中形态学改变:组织块贴壁后三四天,周边有少量滑膜细胞游走爬出。细胞呈多边形或长梭形,有两个或多个突起。培养7d左右,细胞数目增多,逐渐融合。得到第1代滑膜细胞。传代2次以上的滑膜细胞性状稳定,细胞形态以成纤维样细胞为主。②用200μmol/L白藜芦醇分别处理类风湿关节炎滑膜细胞4,8,12,18,24h,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性于4h后明显升高,12h达高峰,持续至24h以上,白藜芦醇组不同处理时间与对照组比较,均显著增高(P<0.05)。③对照组及用50,100,200,400μmol/L白藜芦醇处理滑膜细胞12h,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性分别为(1.00±0.07)、(1.80±0.17)、(1.96±0.18)、(2.45±0.17)、(3.25±0.24),呈浓度依赖性的升高,白藜芦醇组不同浓度与对照组均显著增高(P<0.05)。④对照组及用50,100,200,400μmol/L处理培养的类风湿关节炎滑膜细胞24h,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3酶原的表达随药物浓度的增加而减少,100μmol/L时开始出现活性裂解片断P11(Mr11000),400μmol/L时P11增加。结论:①不同浓度的白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞12h和200μmol/L白藜芦醇处理类风湿关节炎滑膜细胞时,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的相对活性在4h开始升高,12h达高峰后缓慢下降,提示此现象具有浓度和时间的依赖性。②白藜芦醇浓度为400μmol/L时出现天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性裂解片断P11(Mr11000)吸光度积分值高于100μmol/L,证实了在白藜芦醇诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡过程中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3被活化,并发挥了作用。

中药联合窄谱中波紫外线对寻常型银屑病表皮中B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3及生存素的影响

目的探讨中药联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)在调节寻常型银屑病皮损中角质形成细胞凋亡的可能作用。方法选择30例寻常型银屑病患者给予中药银屑病方联合NB-UVB治疗,疗程8周,取治疗前后标本,用免疫组化方法检测正常人(20名)及患者(30例)治疗前后皮损中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、生存素(survivin)的表达。结果寻常型银屑病患者皮损中Bcl-2(7.50±2.01)的表达明显低于正常组(12.65±2.83),Caspase-3(21.73±3.70)的表达明显高于正常组织(8.55±2.16),survivin(23.90±2.82)的表达明显高于正常组织(7.06±1.96,P<0.01);治疗后Bcl-2(13.63±2.14)表达上调,Caspase-3(11.70±2.44)、survivin(12.46±1.80)表达下调(P<0.01),三者均有向正常组织表达转化的趋势。银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分由治疗前(14.24±3.42)下降至治疗后(3.52±1.07,P<0.01))。结论中药银屑病方联合NB-UVB可能通过调节Bcl-2、Caspase-3、survivin的表达而调节角质形成细胞的凋亡达到治疗目的。

急性脑梗死患者血清微小RNA-124和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9水平与预后相关

目的:探讨急性脑梗死(ACI)患者血清微小RNA-124(miR-124)与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的关系,及二者对患者预后的预测价值。方法:收集216例ACI患者为研究对象,选择同期健康体检者86例为对照组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测患者血清miR-124水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清Caspase-9及炎性因子超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、正五聚蛋白(PTX)-3水平。ACI患者根据6个月随访结果分为预后良好组152例和预后不良组64例;分析预后不良组患者血清miR-124、Caspase-9表达水平与炎性因子相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-124、Caspase-9表达水平对患者预后的预测价值;采用Logistic回归方程分析影响预后的因素。结果:预后不良组患者miR-124、Caspase-9、hs-CRP、TNF-α、IL-6、PTX-3高于预后良好组和对照组,低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平及冠心病、糖尿病、大血管闭塞患者比例高于预后良好组(P均<0.05)。预后不良组患者血清miR-124与Caspase-9水平呈正相关(r=0.582,P<0.05),且二者与hs-CRP、TNF-α、IL-6、PTX-3水平呈正相关(P均<0.05)。血清miR-124、Caspase-9水平预测ACI患者预后的曲线下面积(AUC)分别为0.906、0.836,特异性分别为77.6%、88.8%,灵敏度分别为89.1%、71.9%;二者联合预测的AUC为0.920,特异性为90.8%,灵敏度为81.3%。miR-124、Caspase-9、LDL-C、冠心病、糖尿病、大血管闭塞是ACI患者发生不良预后的危险因素(P均<0.05)。结论:联合检测血清miR-124、Caspase-9水平可能有助于早期预测ACI患者预后。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶在急性肾损伤中的研究进展

本篇综述中,我们总结了在脓毒症、缺血/再灌注、药物和横纹肌溶解等诱发的不同急性肾损伤中,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶介导细胞凋亡和焦亡的机制,以利于了解这些调控机制在急性肾损伤发生过程中的重要性,并促进发现治疗和预防急性肾损伤的精确靶点。