局部应用腺苷A2a受体拮抗剂对慢性高眼压大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶(GS)和L-谷氨酸-L-天冬氨酸转运体(GLAST)表达的影响

目的观察腺苷A2a受体拮抗剂对慢性高眼压大鼠视网膜中谷氨酰胺合成酶(glutamamin synthetase,GS)和L-谷氨酸-L-天冬氨酸转运体(L-glutamate-L-aspartate transporter,GLAST)表达的影响,探讨其在高眼压下的视神经保护机制。方法 Sprague Dawley雄性大鼠共66只,均通过巩膜上静脉结扎法制作大鼠慢性高眼压模型,选取右眼作为造模眼,左眼作为对照眼,其中12只于造模后1周、2周和3周测量眼压,观察比较双眼眼压变化情况。余54只随机分为3组,眼局部分别应用SCH442416滴眼液、ZM241385滴眼液和载体滴眼液滴术眼,分别为SCH442416滴眼液组、ZM241385滴眼液和载体滴眼液组,连续滴用3周后采用Real-time PCR和Western blot方法检测视网膜GS和GLAST mRNA和蛋白的表达变化。结果造模后1周、2周和3周造模眼眼压均明显高于对照眼,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。滴用SCH442416滴眼液或ZM241385滴眼液3周后,慢性高眼压大鼠视网膜中GS和GLAST mRNA表达与载体滴眼液组相比均明显升高,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);而SCH442416滴眼液组和ZM241385滴眼液组大鼠视网膜中GS和GLAST mRNA的表达,两组间差异均无统计学意义(均为P>0.05)。同时,SCH442416滴眼液组或ZM241385滴眼液组大鼠视网膜中GS和GLAST蛋白表达与载体滴眼液组比较均明显升高,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);而SCH442416滴眼液组和ZM241385滴眼液组大鼠视网膜中GS和GLAST蛋白的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论巩膜上静脉结扎能建立大鼠高眼压模型,方法稳定可靠。腺苷A2a受体拮抗剂SCH442416和ZM241385对慢性高眼压大鼠视网膜中GS和GLAST的表达具有调控作用,两种不同的拮抗剂作用似乎无明显差异。

谷氨酸-天冬氨酸转运体在豚鼠耳蜗的分布

目的 研究谷氨酸 -天冬氨酸转运体 (glutamate -aspartatetransporters,GLAST)在正常豚鼠耳蜗内的分布 ,为探讨GLAST在防止耳蜗谷氨酸 (Glu)神经毒性中的作用提供形态学基础。方法 选取健康红目豚鼠 6只 ,采用免疫组织化学方法 ,以山羊抗GLAST抗体为标记物 ,观察正常豚鼠耳蜗中GLAST的表达及分布。结果 在正常豚鼠耳蜗的内、外毛细胞 ,内、外毛细胞周围的支持细胞 ,螺旋神经节细胞 ,血管纹边缘细胞和螺旋缘上皮 ,均有GLAST阳性表达。结论 GLAST在正常豚鼠耳蜗内主要分布于内、外毛细胞 ,内、外毛细胞周围的支持细胞 ,螺旋神经节细胞、血管纹边缘细胞和螺旋缘上皮 ,其功能尚需进一步的研究。

关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角谷氨酸天冬氨酸转运体1型的表达

目的:在佐剂性关节炎大鼠模型基础上建立关节炎大鼠慢性吗啡耐受模型,观察兴奋性氨基酸转运体1型(GLAST)在关节炎慢性吗啡耐受大鼠脊髓背角表达变化,探讨GLAST在吗啡耐受形成机制中的作用。方法:将36只健康雄性SD大鼠随机分为6组(n=6),行鞘内置管。其中4组制成佐剂性关节炎模型,分别经鞘内给予生理盐水(A组)、吗啡10μg.kg-1(B组)、吗啡20μg.kg-1(C组)、吗啡10μg.kg-1+纳洛酮10μg.kg-1(D组),另外两组非致炎大鼠分别经鞘内给予生理盐水(E组)、吗啡20μg.kg-1(F组)。各组给药均为1日2次,连续7 d。动态检测大鼠50%缩爪阈值,以免疫组化方法检测脊髓背角GLAST表达。结果:B、C两组关节炎大鼠在鞘内给予吗啡第7天形成较稳定的吗啡耐受,其脊髓背角GLAST表达下调。结论:脊髓GLAST可能参与炎性痛大鼠慢性吗啡耐受的形成机制。

谷氨酸/天冬氨酸转运体抗体对豚鼠听性脑干反应及毛细胞形态的影响

目的研究谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter,GLAST)抗体对豚鼠耳蜗听性脑干反应(ABR)和耳蜗毛细胞形态的影响。方法健康豚鼠20只随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组耳蜗鼓阶内灌注GLAST抗体,对照组灌注人工外淋巴液,观察两组术后3、6、9天ABR反应阈、耳蜗基底膜铺片和透射电镜的形态学改变。结果实验组术后第3天ABR波形消失,术后第9天无恢复;对照组术后第3天8只动物ABR波形消失,术后第6天和第9天全部动物引出ABR波形,平均阈值分别为62.50±5.25、47.50±6.18dBSPL,差异有统计学意义(P<0.05)。随着GLAST抗体灌注后时间延长,实验组内、外毛细胞及纤毛出现不同程度缺失,透射电镜显示内、外毛细胞及神经末梢胞浆、线粒体空化,细胞核染色质边集等凋亡早期征象。对照组的损伤较轻,与ABR阈值改变相一致。结论耳蜗内GLAST抗体灌注后出现耳蜗毛细胞、神经末梢的损伤及ABR波形消失,提示GLAST抗体阻断耳蜗Corti器中的GLAST,导致谷氨酸的神经毒性表达。

活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响

目的研究活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸(GLU)环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达及活性的影响。方法将40只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,每组10只。银杏叶组予银杏叶片水溶剂5.2 mg/kg灌胃,活血通络利水方低剂量组予活血通络利水方合剂20 g/kg灌胃,活血通络利水方高剂量组予活血通络利水方合剂40 g/kg灌胃,正常组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃7 d后,腹主动脉取血后离心收集血清备用。培养Müller细胞,分别用不同浓度的GLU(0、0.1、0.5、1、10、20、25、30 mmol/L)干预24 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测Müller细胞存活率。Müller细胞分为正常组、模型组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,正常组和模型组每孔加入正常血清0.5 mL、培养基2 mL,银杏叶组每孔加入银杏叶含药血清0.5 mL、培养基2 mL,活血通络利水方低、高剂量组每孔分别加入活血通络利水方20、40 g/kg含药血清0.5 mL、培养基2 mL。除正常组外,其余4组均加入GLU 25 mmol/L。相同条件下培养24 h后提取总蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot)检测各组Müller细胞中GLAST、GS蛋白表达水平;用高效液相色谱法(HPLC)检测各组细胞培养液中GLU含量。结果MTT实验结果显示,GLU干预24 h后,与0 mmol/L浓度GLU比较,10 mmol/L及以下低浓度GLU细胞存活率升高(P<0.05);20、25、30 mmol/L浓度GLU细胞存活率逐渐降低(P<0.05),其中25 mmol/L浓度GLU细胞存活率下降至约0.67。Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组GLAST、GS蛋白表达水平均降低(P<0.05);与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组GLAST、GS蛋白表达水平均升高(P<0.05),且活血通络利水方高剂量组的上调高于银杏叶组(P<0.05),与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示,与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组的胞外GLU含量均降低(P<0.05);与银杏叶组比较,活血通络利水方低、高剂量组Müller细胞胞外GLU含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在25 mmol/L GLU浓度环境下,活血通络利水方能够上调Müller细胞GLAST、GS蛋白表达和活性,促进细胞摄取胞外GLU,以维持GLU代谢平衡。

鞘内注射人参皂苷Rg_1对关节炎慢性吗啡耐受大鼠谷氨酸转运体水平的影响

目的探讨鞘内注射不同剂量人参皂苷Rg1对关节炎慢性吗啡耐受大鼠行为学和脊髓背角兴奋性氨基酸转运体1(excitatory amino-acid transporter1,EAAT1)即谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate-aspar-tate transporter,GLAST)表达的影响,进以探讨人参皂苷Rg1对吗啡耐受影响的机制。方法鞘内置管成功并制成佐剂性关节炎模型的健康雄性SD大鼠36只,随机分为6组(n=6),分别经鞘内给予生理盐水10μL(NS组),吗啡10μg(M组),吗啡10μg加人参皂苷Rg150μg(MG50组)、100μg(MG100组)、200μg(MG200组)和单独人参皂苷Rg1100μg(G100组),鞘内注射生理盐水和吗啡每日2次,不同剂量人参皂苷Rg1每日1次,连续7天。动态检测各组大鼠50%机械缩爪阈值(paw withdrawal threshold,PWT),给药后第7天处死大鼠,取脊髓L3～L5节段,以免疫荧光方法检测大鼠脊髓背角GLAST表达水平。结果 M组在给药后第1、3天PWT显著高于NS组(P<0.05),随着用药天数增加,M组PWT逐渐缩短,到第7天与NS组差异无统计学意义(P>0.05),标志吗啡耐受的形成。MG100组PWT也呈下降趋势,但明显缓于M组(P<0.05)。G100组PWT高于NS组(P<0.05)。与NS组相比,M组脊髓背角GLAST表达下调(P<0.01),与M组比较,MG100组和G100组脊髓背角GLAST表达上调(P<0.05)。结论关节炎大鼠单独应用人参皂苷Rg1有轻微的镇痛作用,鞘内给予人参皂苷Rg1100μg有延缓吗啡耐受形成的作用,其机制可能与上调GLAST表达水平有关。

GFAP、GLAST及GLT-1在颞叶内侧癫痫患者海马胶质细胞中的表达

目的：探讨胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、谷氨酸／天冬氨酸转运体（GLAST）及谷氨酸转运体1（GLT-1）在颞叶内侧癫痫患者海马胶质细胞中的表达。方珐：选取本院神经外科住院进行前颞叶切除手术治疗的颞叶内侧癫痫患者62例作为研究对象，根据切除的海马组织在光镜下的情况分为海马硬化组、海马非硬化纽，检测两组GFAP、GLAST及GLT～1并进行比较。结果：GFAP主要表达在胶质细胞的细胞浆和突出部分，在光镜下表现为星状、蜘蛛状，海马硬化组比海马非硬化组更亮，反应性星形细胞增生肥大，并交织成网状，海马硬化组的GFAP在总海马区、CA1区、CA2区、齿状回表达均高于海马非硬化组，差异具有统计学意义（P〈0．05）；GLAsT主要表达在胶质细胞的细胞浆和细胞膜上，海马各区均可见，光镜下CA1区呈现补丁状或斑片状，海马硬化纽GLAsT在CA1区表达减少，而在CA2区表达增多，在齿状回GLAST丢失高于海马非硬化纽，差异具有统计学意义（P〈0．05）；GI，T～1主要表达在胶质细胞的细胞膜上，海马硬化组在CA2区椎体神经元之间的GLT-1表达增强，形成了椎体细胞层的“网格”，而海马硬化组在CA1区GLT—1丢失高于海马非硬化组，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：癫痫频繁发作后海马胶质细胞反应性过度增生、GLAST及GI．T-1的重新分布可能是颞叶内侧癫痫发病的重要原因。

脑源性神经营养因子对急性高眼压后大鼠视网膜 Müller 细胞的影响

目的：检测脑源性神经营养因子(BDNF)干预急性高眼压后大鼠视网膜 Müller 细胞谷氨酰胺合成酶(GS) 和谷氨酸/天冬氨酸转运体(GLAST)表达的变化,探讨 BDNF 保护节细胞(RGCs)的可能机制。方法：成年大鼠分为3个 BDNF 干预组和3个溶媒对照组并进行玻璃体内注射。2 d 后将预处理动物左眼眼压升高至闪光视网膜电图 b 波消失的临界眼压且维持缺血60 min。实验动物分别存活1、3或7 d 后通过免疫组织化学检测大鼠视网膜 GS 和 GLAST 的表达变化。结果：与正常对照组比较,溶媒对照组 GS 和 GLAST 在存活1 d 和3 d 时表达上调,7d 时下降；BDNF 干预组未出现表达明显变化。结论：BDNF 可能不是通过 Müller 细胞上调 GS 和 GLAST,降低胞外 Glu 来保护 RGCs。

眼镜蛇镇痛素对大鼠神经病理性疼痛脊髓GLAST mRNA的影响

目的:观察椎管内注射眼镜蛇毒najanalgesin对大鼠L5脊神经结扎并剪断(spinalnerve ligation and transection,SNL)术后脊髓谷氨酸-天冬氨酸转运体GLAST(glutamate-asparate transporter,GLAST)mRNA表达的影响,探讨najanalgesin脊髓镇痛机制。方法:采用L5SNL模拟神经病理性疼痛,von Frey hair测定大鼠术侧后足50%机械刺激撤足反射阈值(50%paw withdrawal threshold,PWT)判断模型成功,real-time PCR检测SNL 7 d后脊髓L4-L6GLAST mRNA表达。结果:SNL诱导大鼠产生了机械痛敏,表现为50%机械刺激PWT降低,模型复制成功。SNL 7 d后脊髓GLAST mRNA表达降低,椎管内给予najanalgesin剂量相关上调SNL大鼠脊髓GLAST mRNA的表达。结论:Najanalgesin可以增加脊髓GLAST mRNA的表达,可能是其脊髓镇痛机制之一。

白藜芦醇对大鼠海马缺血再灌注损伤的保护机制

目的研究白藜芦醇（resveratrol,Res）对脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤保护作用的可能机制。方法 90只大鼠随机平均分为9组,假手术组（A组）、术后持续缺血组（B1组）和缺血再灌注后丙二醇溶液组（B2组）、持续缺血后Res干预组（C1~C3组）和缺血再灌注后Res干预组（D1~D3组）,Res浓度分别为10~8 g/kg、10~7 g/kg、10~6 g/kg。大鼠脑缺血2 h后再灌注,之后Res治疗3天。反相高效液相层析检测海马组织谷氨酸（glutamate,Glu）含量,免疫组化方法测定谷氨酸/天冬氨酸转运体（glutamate/aspartate transporter,GLAST）及谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1,GLT-1）蛋白阳性的表达。结果与B1~B2组比较,C1~C3组和D1~D3组Glu含量明显降低,同时GLAST和GLT-1的表达升高。结论 Res通过提高GLAST和GLT-1的表达,降低Glu含量,起到脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用。

鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸摄取功能的影响

目的研究鱼藤酮对原代培养星形胶质细胞谷氨酸转运功能的影响。方法应用HPLC荧光法检测鱼藤酮染毒星形胶质细胞胞外Glu浓度,同位素标记法检测Glu摄取能力,采用RT-PCR与Western blot技术观察谷氨酸转运体基因及蛋白表达。结果鱼藤酮染毒星形胶质细胞胞外Glu浓度明显升高,Glu摄取能力显著降低,谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter,GLAST)基因和蛋白表达均明显降低,而谷氨酸转运体-1(glutamatetransporter-1,GLT-1)蛋白表达升高。结论鱼藤酮可显著降低星形胶质细胞谷氨酸摄取功能,引起胞外Glu浓度升高;GLAST表达下调可能是鱼藤酮诱导胞外谷氨酸含量增加的主要原因之一,而GLT-1上调可能为神经细胞自我保护机制,以限制谷氨酸的神经毒作用。

α7-nAChR介导的小花棘豆臭豆碱对小鼠海马组织谷氨酸代谢的调控机制

臭豆碱是小花棘豆的主要有毒成分之一,本试验目的是证明臭豆碱通过作用α7烟碱乙酰胆碱受体(α7-nAChR)调控谷氨酸代谢的毒理作用。结果显示,9 mg/kg和18 mg/kg臭豆碱口服剂量可激动小鼠海马组织α7-nAChR,促进谷氨酸释放及上调谷氨酸/天冬氨酸转运体(GLAST)表达,该效应可被α7-nAChR抗激动剂MLA抑制。但是,36 mg/kg臭豆碱口服剂量却增加小鼠海马谷氨酸浓度及下调GLAST表达。结果表明,超过36 mg/kg臭豆碱剂量则通过抑制α7-nAChR降低GLAST表达,导致谷氨酸代谢障碍从而具有潜在的谷氨酸神经毒性。

脑源性神经营养因子对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的探讨脑源性神经营养因子对糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用。方法健康雄性SD大鼠54只,腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。随机分为对照组、糖尿病组、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)组。含0.1 g·L^(-1)BSA的PBS平衡盐溶液制备BDNF注射液。BDNF组大鼠于糖尿病模型建成4周后开始注射BDNF注射液,对照组和糖尿病组注射等剂量的PBS平衡盐溶液。8周后,利用免疫荧光及Western blot检测胶质细胞谷氨酸转运体(L-glutamate/L-aspartate transporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)及神经元标记物SYN(synaptophysin)的表达量,谷氨酸含量测定试剂盒检测视网膜中谷氨酸的含量。结果与对照组相比,糖尿病组GLAST、GS、SYN表达显著下降,且视网膜谷氨酸含量均明显升高(均为P<0.01),而BDNF组差异均无统计学意义(均为P>0.05);与糖尿病组相比,BDNF组GLAST、GS、SYN表达均升高(均为P<0.01),谷氨酸含量均显著减少(均为P<0.01)。结论糖尿病视网膜病变早期给予外源性BDNF可以提高Müller细胞中GLAST、SYN及GS表达活性,改善Müller细胞功能,并且能使视网膜神经节细胞免受损害,提示BDNF对糖尿病视网膜病变条件下视网膜中的Müller细胞具有保护作用。

白藜芦醇对大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用研究

目的研究白藜芦醇（Res）对脑缺血再灌注损伤的保护作用和可能机制。方法135只大鼠按照随机数字表法分为9组，每组15只。A组为假手术组，B1、B2组分别为术后持续脑缺血和缺血再灌注后丙二醇溶液组，C1-C3组为持续脑缺血后Res干预组，D1-D3组为缺血再灌注后Res干预组，药物剂量分别为10^-8g／kg、10^-7g／kg、10^-6g／kg。假手术组大鼠只分离右侧颈总动脉及颈内外动脉：脑缺血大鼠采用线栓法制作大脑中动脉栓塞模型：脑缺血再灌注大鼠缺血2h后再灌注；Res干预大鼠于再灌注2h后采用Res治疗3d。所有大鼠采用TTC法测量脑梗死体积，采用干湿重法测定脑含水量，免疫组化染色测定谷氨酸／天冬氨酸转运体（GLAST）及谷氨酸转运体-1（GLT-1）蛋白表达。结果与B组比较，C组和D组中高剂量Res亚组能明显降低大鼠神经功能评分（D3组大鼠评分最低，为1．30±0．481，缩小脑梗死体积（D3组大鼠脑梗死体积比例最低，为16．00％±6．20％），降低脑含水量（D3组大鼠脑含水量最低，为52．30％±8．25％），提高GLAST和GLT-1的表达（D3组大鼠2种蛋白表达量最高，分别为39．98±0．77、171．76±7．22）。结论Res通过提高GLAST和GLT-1的表达，降低梗死区谷氨酸浓度，缩小脑梗死体积和减轻脑水肿来起到脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用。