Boc-L-天冬酰胺与正己胺的缩合反应研究

氨基酸因含有氨基、羧基等活性基团,易于对其结构进行调控,是构筑小分子有机凝胶的常用骨架或切块。以天冬酰胺为基本骨架,将羧酸位点与正己胺进行缩合反应,形成酰胺键,是一种良好的凝胶因子中间体。研究了Boc-L-天冬酰胺与正己胺的缩合反应,考查了有机碱、反应溶剂和反应温度对反应的影响。条件优化之后发现使用DCC作为缩合剂,DIPEA提供碱性环境,25℃下在DCM溶剂中反应,反应收率可达74%。合成的目标化合物结构经过~1H NMR表征确认,该工艺条件温和,操作简单,效率高。

(叔丁氧羰基)-L-天冬酰胺的合成研究

研究了(叔丁氧羰基)-L-天冬酰胺的合成,并对该工艺条件进行了方法学研究。L-天冬酰胺、氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯溶于水和1,4-二氧六环中,在20℃下反应12h。该工艺方法得到84%的收率,且反应条件简单温和,工艺设备成本廉价,实现了操作简单、经济实惠和绿色环保的目的。

仿生聚天冬酰胺衍生物聚合物胶粘剂的制备及其性能

用于组织固定和伤口护理的生物胶粘剂的开发仍然是一个挑战。本研究采用聚琥珀酰亚胺为基体,引入三种不同组合的多巴胺(DOPA)、乙醇胺(EA)和疏水氨基辛烷(OA),合成了聚天冬酰胺衍生物,并通过连续氨解反应分别制备了聚天冬酰胺衍生物PolyAspAm(DOPA/EA)和PolyAspAm(DOPA/OA/EA)胶粘剂。研究结果表明:(1)不同含水量的PolyAspAm(DOPA/EA)胶粘剂在玻璃基材上的拉伸剪切强度具有较大差异,且含水量降低,拉伸剪切强度变大。当PolyAspAm(DOPA/EA)胶粘剂中水分含量降低到7%时,拉伸剪切强度明显升高到0.6 MPa。(2)PolyAspAm(DOPA/OA/EA)胶粘剂在不同基材上的拉伸剪切强度均大于PolyAspAm(DOPA/EA)胶粘剂。在常用基材如玻璃、塑料基材(PMMA)和锡箔纸上,PolyAspAm(DOPA/OA/EA)胶粘剂的拉伸剪切强度可分别达到(0.36±0.032)MPa、(0.28±0.021)MPa和(0.29±0.024)MPa。(3)PolyAspAm(DOPA/OA/EA)胶粘剂具有较好的粘接稳定性,对玻璃基材应用14 d后,拉伸剪切强度达到最高值(0.65±0.029)MPa。(4)在PolyAspAm(DOPA/OA/EA)聚合物中引入物质的量为5%的高碘酸钠,可以提高胶粘剂的内聚力,对玻璃基材的拉伸剪切强度从(0.36±0.032)MPa提高到(0.51±0.039)MPa。

酶解-柱前衍生UPLC法检测特医食品中天冬酰胺及谷氨酰胺

建立酶水解-丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品(FSMP)中天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的方法。样品经灰色链霉菌蛋白酶(Pronase E)酶解后,取上清液与Dns-Cl进行柱前衍生,衍生化产物经Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,以10 mmol/L磷酸氢二钠溶液(pH 6.5)和甲醇作为流动相进行梯度洗脱,外标法定量。结果表明,两种氨基酸在0.500~50.0μg/mL浓度范围内线性良好(R≥0.999),回收率为95.3%~105%,RSD为0.95%~3.22%。方法用2种蛋白标准品进行酶切效率与实测含量验证,准确度良好(δ<10%),可用于FSMP中Asn和Gln含量检测,并正在用于制定食品安全国家标准。

L-天冬酰胺酶在肿瘤中的研究进展

氨基酸代谢与细胞氧化应激、细胞增殖和细胞凋亡等多种细胞过程相关,参与糖尿病、衰老、肿瘤等生理病理过程。L-天冬酰胺酶(L-asparaginase,L-ASP)是氨基酸代谢途径中的关键酶,能够水解天冬酰胺生成天冬氨酸和氨,参与细胞增殖、凋亡、迁移以及侵袭等生物过程。研究表明,L-天冬酰胺酶影响白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生和发展。本文主要从L-天冬酰胺酶的结构、酶学作用、与其他药物联用对多种肿瘤治疗的潜力进行综述。

天冬酰胺合成酶通过促进β-catenin核转位驱动胆管癌转移

目的:检测天冬酰胺合成酶(ASNS)在胆管癌(CCA)中的表达情况,探讨ASNS在CCA转移中的作用及其机制。方法:通过公共数据库分析各肿瘤组织中ASNS的mRNA表达;收集CCA患者病理组织(n=27),构建硫代乙酰胺诱导的大鼠自发CCA模型和左中位胆管结扎联合二乙基亚硝胺诱导的小鼠自发CCA模型,通过免疫组化、Western blot和免疫荧光法检测ASNS蛋白表达。采用CCK8、划痕和Transwell实验检测ASNS对人CCA细胞HuCCT1和HCCC-9810增殖、迁移和侵袭的影响。构建ASNS稳定敲减的CCA细胞株HuCCT1^(shNC)、HuCCT1^(shASNS)、HCCC-9810^(shNC)和HCCC-9810^(shASNS),通过肝原位种植和尾静脉注射研究ASNS对CCA细胞肝内生长和肺转移的影响。利用公共数据库富集与ASNS相关的信号通路,并用免疫荧光和Western blot验证相关分子机制。结果:无论在人或动物CCA组织中,ASNS表达水平均高于癌旁组织(P<0.01)。ASNS以酶活性非依赖性方式促进CCA细胞HuCCT1和HCCC-9810的增殖、迁移与侵袭。生物信息学分析显示,β-catenin在ASNS高表达的CCA组织中富集,ASNS通过促进β-catenin核转位,启动CCA细胞上皮-间充质转化(EMT)。β-catenin抑制剂XAV-939可显著抑制CCA细胞的侵袭与迁移。结论:ASNS在CCA中高表达,通过促进β-catenin核转位,介导EMT,驱动CCA转移。

天冬酰胺类抗体-药物偶联物连接子的合成新工艺

为了提高抗体-药物偶联物(Antibody-drug conjugate,ADC)的连接子4-N-(N-(L-丙氨酰-L-丙氨酰)-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺酰基)-氨基苯甲醇(NH_(2)-AAN(Trt)-PAB)的合成效率,设计了一条新的合成路线。以N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺为起始原料,经过氨基酸缩合、氨基脱保护4步反应,高效合成了NH_(2)-AAN(Trt)-PAB。LCMS、1H NMR分析表征结果表明成功合成了NH_(2)-AAN(Trt)-PAB。该研究具有操作简便、条件温和可控、合成效率高、总产率较高等特点,有利于NH_(2)-AAN(Trt)-PAB的放大生产及其在ADC药物研发中的应用,同时对其他蛋白酶可裂解连接子的合成具有借鉴意义。

非天然氨基酸β-Homo天冬酰胺的合成研究

以α-氨基酸天冬酰胺为原料,经多步反应合成了β-氨基酸β-Homo天冬酰胺,中间产物和目的产物经熔点、红外、核磁、质谱以及元素分析,其结构得到证实。

聚天冬酰胺衍生物的合成及细胞毒性研究

目的合成一种聚天冬酰胺衍生物并对其细胞水平的安全性进行评价,为其作为药物载体应用提供研究基础。方法通过L-天冬氨酸热缩聚合成聚琥珀酰亚胺,利用苯丙氨酸甲酯盐酸盐和乙醇胺对聚琥珀酰亚胺进行开环反应得到载体PSI-Phe-EA;利用1H NMR进行聚合物结构表征;采用内标法磁氢谱计算其开环率;通过水溶性的比较验证其亲水性变化;采用MTT法对聚合物的细胞增殖抑制进行研究,利用倒置显微镜观察聚合物对细胞微观形态的影响;利用碘化丙啶(PI)染色法通过流式细胞仪研究聚合物对细胞周期的影响。结果1H NMR确证了开环衍生物PSI-Phe-EA的结构,PSI的开环率为40%;乙醇胺开环后聚合物的亲水性得到了明显改善;MTT实验表明,PSI-Phe-EA在所检测浓度范围内(<100 mg/L),对NIH3T3和Hep G2两种细胞的24 h细胞存活率均在80%以上;倒置显微镜观察表明,50 mg/L的PSI-Phe-EA孵育24 h后以上两种细胞的形态与对照组无明显差异;细胞周期分析表明PSI-Phe-EA处理与否对细胞周期分布的影响无明显差异。结论合成的聚天冬酰胺衍生物PSI-Phe-EA亲水性明显提高,且对细胞的存活、微观形态以及周期分布均无明显影响,是一种安全的高分子材料。

聚-(羟丙基、丙基)-天冬酰胺材料体外酶解及植入小鼠体内的观察

目的 :观察 4种不同摩尔比的聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料在体外酶解和植入小鼠体内后的变化。方法 :用木瓜蛋白酶和胰酶对材料作了体外酶解试验 ,用凝胶色谱法对降解物碎片作了测定 ;用光镜、扫描电镜、透射电镜等对材料在埋植部位、肝、肾组织内的降解碎片进行观察 ;对材料植入小鼠体内后的生化指标 (血红蛋白、白细胞、谷丙转氨酶、肌酐作了测定。结果 :聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料在体外能被逐步酶解。在植入小鼠体内的 5周内 ,在埋植部位、肝、肾组织内能观察到材料的碎片。结论 :聚 -(羟丙基、丙基 ) -天冬酰胺材料能在体内、外逐步降解 ,植入小鼠体内后对动物的血象、肝、肾功能无明显的影响 。

“一锅法”生物转化富马酸制备L-天冬酰胺

L-天冬酰胺广泛应用于食品、医药、化工合成和微生物培养等领域。目前工业上主要依靠化学合成和直接提取方法制备。该研究首次采用双酶催化富马酸"一锅法"制备L-天冬酰胺。克隆来源于大肠埃希氏菌JM109的天冬酰胺合成酶A基因asn A,并于产L-天冬氨酸酶的E.coli CICC 11022S中表达,表达的蛋白分子质量约为37 k Da,与预期大小相符,比酶活力为1443.7 U/g。利用构建的工程菌E.coli CICC 11022S/p ET28a(+)-asn A全细胞高密度催化富马酸生产L-天冬酰胺,以高效液相色谱法及PITC柱前衍生-高效液相法检测底物、中间产物和终产物,转化10 h,富马酸转化率为94.7%,L-天冬酰胺产量可达125.1g/L,生产速率为12.51 g/(L·h)。

生物材料聚(乳酸-天冬酰胺)的制备与表征

以氯化亚锡为催化剂,L-乳酸(LA)与天冬酰胺(Asn)直接熔融聚合,所得生物材料聚(乳酸-天冬酰胺)[P(LA-co-Asn)]用[η]、红外光谱(FT-IR)、核磁共振(1H-NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)、差示扫描量热分析(DSC)、X射线衍射(XRD)等方法进行表征。随着投料比中Asn增加,共聚物由结晶性逐渐转变为无定型态,M-w逐渐降低(9,500～2,700),但能满足药物缓释要求。该合成方法经济、简单易行。与具有一定分支结构的聚(乳酸-天冬氨酸)相比,新型直链共聚物P(LA-co-Asn)侧链中伯酰胺可望进一步结合生物活性分子以改善聚乳酸的生物相容性。

聚天冬酰胺键合胰蛋白酶亲合手性固定相的初步研究—Ⅰ

目的 :将胰蛋白酶通过N ,N′-羰基二咪唑以共价结合的方法键合于双亲性载体聚 - (羟丙基 ,丙基 ) -DL -天冬酰胺材料上 ,制成亲合手性固定相。方法 :用X -衍射、扫描电镜等方法进行了表征。对固定相进行了pH、温度、时间及热稳定性等优化条件的选择。结果 :固定相在 37℃～ 45℃能稳定存在 ,在pH 7 4～ 10 6 ,37℃条件下有稳定的酶活性。结论 :该固定相有可能成为蛋白分离的固定相。

不同裂解条件对天冬酰胺主要裂解产物的影响

采用在线裂解气相色谱-质谱联用技术(Py/GC-MS)对不同条件下天冬酰胺的主要裂解产物进行分析,并通过裂解同位素标记样品,计算主要含氮裂解产物中的同位素比例,推测其形成途径,研究裂解条件对主要裂解产物形成的影响。结果表明:温度对天冬酰胺裂解影响较大,主要裂解产物在低温和高温下生成量变化较大。300℃时,马来酰亚胺和琥珀酰亚胺为主要的裂解产物,300～600℃时生成量显著增加,600～900℃时马来酰亚胺生成量缓慢增加而琥珀酰亚胺逐渐降低;随着温度升高,酸类和酰胺类物质生成量持续增加;腈类和吡咯类物质在高温下生成量明显增加。此外,温度对含氮裂解产物的形成途径也有较大影响。马来酰亚胺、乙酰胺在低温下N主要来源于标记的酰胺N,而在高温下主要来源于未标记的氨基N。氢氰酸、乙腈和丙烯腈中的N原子均主要由未标记的氨基转变而来,且随着温度升高,这种生成途径所占比例越高。而裂解气氛和裂解时间对天冬酰胺主要裂解产物的生成量及途径影响较小。

5-氟尿嘧啶-聚α,β(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺的合成及体内释放的研究

以５氟尿嘧啶为模型药物，将药物以共价键的形式键合于生物降解型高分子材料聚α，β（２羟乙基）ＤＬ天冬酰胺上制成高分子载体药物，药物接入率达３７１％（ｗ／ｗ）。用红外和差热分析法对载体药物进行了表征。以纯种大白兔为实验动物，把载体药物制成混悬型和棒状型两种剂型，进行药物体内释放实验。结果表明：以棒状型药物给药在一定程度上可以降低释药初期的“爆释”现象，为进一步临床应用提供了重要依据。

α,β-聚-DL-天冬酰胺衍生物水凝胶的合成及其溶胀性能研究

以ＤＬ天冬氨酸为单体，通过缩合聚合反应合成聚ＤＬ丁二酰亚胺，然后用不同比例的乙醇胺和丁二胺进行开环和交联，获得α，β聚ＤＬ天冬酰胺衍生物水凝胶．测定了水凝胶在几种不同溶液中的溶胀比，结果表明该水凝胶在蒸馏水中的溶胀比为１１０～４４０倍，在不同浓度的盐溶液中的溶胀比有不同程度的降低，在０１６ｍｏｌ／Ｌ的抗肿瘤药物５氟尿嘧啶（５Ｆｕ）水溶液中的溶胀比可达１４０倍．研究了聚丁二酰亚胺分子量、溶剂用量及交联剂用量等因素对凝胶溶胀性能的影响．

乙酰水杨酸－聚天冬酰胺棒状药物体外释放的研究

以乙酰水杨酸为模型药物，将药物以共价键键合于聚天冬酰胺高分子母体，制成棒伏。体外释放在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ＰＨ７．４）缓冲溶液介质中，温度为３７±０．１℃时，其释放初期的释药量为其膜剂的近１／３０，能较好地控制释药初期的“爆释”现象。

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

几种因素在L-天冬酰胺酶化学修饰中对酶活力及抗原性的影响

为了寻求在较好地保持酶活力的同时解除L-天冬酰胺酶抗原性的方法,采用不同分子量的乙酸酐、右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇,作为修饰剂和不同的修饰方法对该酶进行了化学修饰。结果表明在保持酶活性和降低抗原性方面,大分子修饰剂右旋糖酐、单甲氧基聚乙二醇优于小分子乙酸酐,底物保护修饰优于直接修饰;活化PEG,优于活化PEG_1。在底物保护下的PEG,修饰酶其抗原性完全解除的同时,酶活力保持在30%以上。

L-天冬酰胺酶工程菌株培养条件及稳定性

Ｌ天冬酰胺酶工程菌株的酶活和表达水平受菌体生物量和诱导时间的影响。在生物量Ａ６０００３ ×１０ 左右，热诱导４ｈ 酶活力和表达水平可达到较高水平。葡萄糖对酶的生成有阻遏作用，当葡萄糖浓度大于０２５ ％ 时，对工程菌酶的合成造成阻遏。确定了工程菌培养的培养基、ｐＨ 值、接种量等因素。重组质粒ｐＡＳＮ 在Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５ ，ＴＧ１ 和ＡＳ１３５７ 等宿主菌中具有很好的稳定性，工程菌培养５０ 代以上重组质粒保留９０ ％ 以上，在ＬＢ 和Ｍ３