天冬酰胺合成酶B抑制剂高效液相色谱筛选方法的建立与应用

建立了一种快速、高效测定天冬酰胺合成酶B(AS-B)酶活性的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。酶反应体系中的氨基酸经2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生,通过RP-HPLC测定酶反应体系前后底物及产物的变化来分析酶的活性。采用的色谱柱为AgilentC18柱(250mm×4.6mm,5μm),以50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6.2)-乙腈(体积比为15∶85)为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为30℃,检测波长365nm,于6min内实现了各组分的基线分离。通过该方法测定反应动力学参数进行AS-B的抑制定量分析。将已知AS-B抑制剂L-谷氨酸-γ-甲酯作用于酶反应体系,测得的抑制剂的抑制常数与文献值相接近,证明该方法可用于AS-B抑制剂的筛选。

大豆天冬酰胺合成酶B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank登陆大豆天冬酰胺合成酶(AS-B)基因序列(登录号:GMU55874)设计特异引物,通过PCR扩增从大豆(Glycine max)cDNA中克隆出AS-B基因。将该基因克隆到pET30a(+)载体,构建重组表达载体pET30a-AS,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,并进行表达条件优化。结果表明,在16℃条件下,经0.5mmol·L-1IPTG诱导14 h,大部分重组AS-B以可溶性蛋白的形式存在。经Ni-NTA亲和层析和Sephadex G50脱盐后,重组蛋白产率为23.4 mg·L-1,纯度>90%,以L-谷氨酰胺和NH4Cl为氮源供体时,其比活力分别为2.32和2.60μmol·min-1.mg-1。研究结果为研究大豆AS-B结构与功能和酶催化动力学机制及建立AS-B抑制剂的高通量筛选平台奠定基础。

植物氮代谢中天冬酰胺合成酶B的研究进展

天冬酰胺合成酶B(Asparagine synthetase B,AS-B,EC 6.3.5.4)是植物氮代谢中的关键酶,在植物氮素同化与分配上发挥着重要作用,其产物天冬酰胺(Asn)是植物体内有机氮运输和储存的主要形式之一。近年来,对AS-B的研究取得很大进展,本文就AS-B的结构、分类、反应机制、表达模式以及生物学功能进行全面的阐述,为利用分子育种方法提高作物或林木的氮素利用率奠定理论基础。