天山根瘤菌（Rhizobium tianshanense）全细胞蛋白电泳和多位点酶电泳分析

用全细胞可溶性蛋白电泳和多位点酸电泳对１５株天山根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ）和其它１０株快慢生根瘤菌进行聚类分析，结果表明Ｒ．ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ种内菌株关系密切而与其它种不同。分析时将全细胞蛋白电泳图谱分为２５４等份，根据每等份内条带的有无进行聚类，结果与数值分类基本一致，说明用该方法对全细胞蛋白电泳结果进行聚类可以作为根瘤菌的分群手段；用所有出现的１０９种迁移率对１７种多位点酶的电泳结果作聚类分析，得到与全细胞蛋白电泳相似的结果。

天山根瘤菌(R.tianshanense)模式菌株16SrDNA全序列测定及其系统发育

对天山根瘤菌群的模式株A－IBS（＝CCBAU3306）16SrDNA的全序列进行了测定，以确定它在系统发育中的地位。实验中设计了6个引物，通过聚合酶链反应扩增天山根瘤菌模式菌株A－IBS的16SrDNA。应用DNA定向测序技术，获得了菌株A－IBS的16SrDNA全序列，将所得序列与根瘤菌已知种的模式菌株16SrDNA全序列一起进行聚类分析，得到了系统发育树状图。在树状图中，菌株A－IBS所代表的根瘤菌群与华癸根瘤菌（R．huakuu）群、鹰嘴豆根瘤菌（R.ciceri）群、地中海根瘤菌（R．mediterrranean）群及百脉根根瘤菌（R．loti）群的亲缘关系较近，与其它根瘤菌群的亲缘关系较远，存在着属水平的差异，表明了这些相近根瘤菌群构成了根瘤菌的一个独立的发育系。

植物细菌天山根瘤菌调控基因mrtR在群体感应中的作用

在许多种类的细菌中均发现了luxR/luxI类型的群体感应调控系统,其中luxR是调节基因,对luxI合成自体诱导物(AI,autoinducer)起着正调控作用。通过建库筛选后,测序比对发现天山根瘤菌中存在mrtR/mrtI系统。通过基因敲除和转录水平基因表达对mrtR进行研究,发现mrtR严格调控着mrtI的表达,同时mrtR的表达也受到AI影响,这表明mrtR表达的调控是一种自调控,同时根毛吸附实验显示该基因对根瘤菌与宿主间相互作用密切相关。

中慢生型天山根瘤菌中MrtR蛋白的融合表达研究及鉴定

通过PCR扩增出中慢生型天山根瘤菌中群体感应调控蛋白MrtR的基因片段,克隆至表达载体pALEX中,从而构建了原核表达质粒pALEX-mrtR。将pALEX-mrtR转化至大肠杆菌BL2/DE3菌株感受态细胞中,经IPTG诱导,表达出58kD的GST-MrtR融合蛋白。用纯化好的GST-MrtR制备多克隆抗体,经Westernblot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。MrtR融合蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究MrtR蛋白的功能奠定了基础。

中慢生型天山根瘤菌中自体诱导物分子结构的鉴定

通过用乙酸乙脂分别对天山根瘤菌CCBAU3306培养物上清液中自体诱导物分子进行抽提、浓缩,并采用液质联用对自体诱导物分子进行结构分析,最终获得该根瘤菌所产生酰基高丝氨酸内酯类信号分子的结构,并采用纯品进行活性的比较,发现调控蛋白与纯品结合后具有生物活性,能与目的DNA片断结合,证明了该结构的准确性。

中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A自体诱导物合酶基因的筛选及其在大肠杆菌中的表达

细菌在高细胞密度下可以产生化学信号分子调控细菌相关基因的表达,这种信号分子被称为自体诱导物(Autoinducer,AI)。采用检测菌株JZA1在中慢生型天山根瘤菌CCBAU060A(Mesorhizobium tianshanenseCCBAU060A)培养上清液中检测到了高活性的自体诱导物;利用转座子随机突变的方法获得了AI缺失突变株,并克隆得到了相关的自体诱导物合酶基因;将自体诱导物合酶基因在大肠杆菌中进行表达,对大肠杆菌重组菌株进行自体诱导物检测发现,该合酶基因在大肠杆菌中能够合成四种自体诱导物分子。

外源AHL对中慢生型天山根瘤菌群体感应系统作用的初步研究

通过将天山根瘤菌中的自体诱导物合成酶基因mrtI在转录水平融合lacZ构建了5’mrtI-lacZ融合表达菌株HMZ1。利用多株不同属的根瘤菌上清液对该菌株进行诱导,发现有3株豌豆根瘤菌和1株三叶草根瘤菌上清提取物能诱导mrtI基因的表达,且外源上清量越多,mrtI被诱导的程度越高,TLC的结果则显示它们可能有着相同的AI。该结果显示在相同功能的细菌间存在信号交流,为进一步研究群体感应调节在共生固氮上的作用提供了理论及实践依据。