一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台。方法收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5′端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3′端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库。结果成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上。结论成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台。

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA(A/Anhui/1/2005)对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的:构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血中分离淋巴细胞,以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因,并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中。以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1,构建人源天然噬菌体抗体库,测序分析抗体基因的家族信息和多样性,并用多种抗原对其进行筛选。结果:获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库。分别用5种抗原对其进行筛选,均可获得特异性噬菌体抗体的富集。结论:成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建

目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。

人源性单链抗体在生殖器疱疹治疗中的应用

单链抗体（scFv）是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过一短肽链连接后融合表达出来的抗体片段，其大小为完整抗体分子的1／6，有与天然抗体相同的抗原结合特征，它又缺乏Fc片段，失去了Fc介导的受体结合作用．使得其快速向靶部位集中；同时scFv还具有分子量小，易入靶细胞，有较强的组织穿透力；免疫原性低，不易产生人抗鼠抗体反应；无Fc段，不易与靶细胞外的细胞结合。且组织分布率高等特点。由于scFv具有以上优点，可以将单纯疱疹病毒（HSV）scFv基因与干扰素基因偶联．是十分有希望的抗HSV感染的基因治疗方案。构建人源性scFv为生殖器疱疹（GH）的研究提供了一个新的平台。

禽流感病毒H7N9人源性单链抗体文库的构建及鉴定

目的构建人源性禽流感病毒H7N9单链抗体文库(scFv),并对文库质量进行鉴定。方法分离11例H7N9恢复期患者外周血中的单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA;并以此为模板PCR扩增人源性抗体重链可变区(VH)及轻链可变区(Vκ),再通过重叠PCR法将VH和Vκ基因随机拼接成scFv文库;将构建的scFv文库克隆入噬菌体载体pComb3XSS中,电转化感受态细胞XL1-Blue,制备成完整的人源性禽流感病毒H7N9单链抗体文库;通过计算菌落数量及基因测序检测分析scFv文库的库容量及多样性。结果构建的人源性禽流感病毒H7N9单链抗体文库的库容为1.67×107,测序结果显示scFv文库多样性好,scFv基因阳性率为94.0%,准确率为95.7%。结论成功构建人源性禽流感病毒H7N9单链抗体文库,为后续筛选特异性中和抗体提供了基础。

大容量天然鸡源噬菌体单链抗体库的构建

目的本研究拟构建大容量天然鸡源噬菌体单链抗体库,用于传染病诊断用抗体筛选。方法选取未经免疫的5周龄白来航鸡包括普通级别和无特定病原体级别、罗曼鸡、洛岛红鸡、洛岛白鸡和贵妃鸡,每个品种各5只,共30只。从法氏囊中提取总RNA,通过反转录合成cDNA。利用聚合酶链式反应技术扩增全套编码抗体可变区的基因序列。通过重叠延伸反应,将重链可变区和轻链可变区基因连接成为单链抗体。将经过回收并酶切纯化的单链抗体克隆到噬菌体载体上,电转化大肠埃希菌TG1感受态细胞。结果成功构建库容量达1010的鸡源天然单链抗体库细胞库,噬菌体展示库滴度达1012菌落形成单位/mL以上。随机挑选165个单克隆进行菌落PCR鉴定,转化阳性插入率为96.97%(160/165);随机选取72株阳性克隆进行测序,抗体互补决定区3碱基序列及长度存在显著差异,表明构建的抗体库多样性良好。结论本研究成功构建了大容量鸡源天然单链抗体库,为后续从中筛选出具有应用价值的特异性单链抗体奠定了基础。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

单链抗体的研究进展

抗体技术由细胞工程抗体 (杂交瘤 -单克隆抗体 )发展到基因工程抗体 ,尤其是抗体库技术的出现 ,将抗体工程发展到了一个新阶段。本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体 (single- chain Fv antibody,sc Fv)的进展情况。

从噬菌体单链抗体库中筛选MMP7单链抗体

目的:从人天然噬菌体单链抗体库中筛选与MMP7特异结合的单链抗体(scFv),并对其特异性及活性进行分析。方法:转化MMP7质粒,分离、纯化与鉴定表达的MMP7。以MMP7为靶标对人天然噬菌体单链抗体库进行4轮的筛选富集,初步筛选到能与MMP7结合的scFv。通过ELISA和Western对所获scFv的特异性进行分析。结果:分离纯化鉴定了MMP7,筛选获得了结合MMP7的人噬菌体抗体。ELISA和Western表明筛选到的scFv特异性较好。结论:利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源MMP7抗体,为抗MMP7单抗药物的研发提供了新的可能性。

抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定

目的筛选盐酸克伦特罗(CLB)人源单链可变区(ScFv)抗体,为研究快速检测试剂(盒)提供基础依据。方法采用噬菌体表面展示技术,以CLB作为抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选抗CLB的60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与CLB结合活性较强的ScFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-B lue,提取质粒进行DNA序列测定;并对CLB ScFv的编码基因序列分析。结果经过筛选60个克隆中有15株克隆ELISA的吸光度(A490nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆。亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-B lue,提取质粒进行DNA序列测定;DNA为750 bp;经BLAST分析,此片段属于新抗体基因序列,GenBank注册号为:EU681272。结论本实验用噬菌体抗体库技术能够初步获得抗CLB的ScFv抗体,为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件。

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Aβ_(1-42)寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L。Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础。

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值

目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体,用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库。方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者。从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断。用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1。用辅助噬菌体M13K07援救转化后的TG1,产生ScFv。结果95例慢性ITP患者中41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%)。2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能。扩增出380～400bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780bp大小的ScFv片断。ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆。用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml。结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能。用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/ⅢaScFv。