天花粉蛋白(TCS)诱导肿瘤细胞凋亡及其抗肿瘤作用机制的研究进展

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是一种植物蛋白,具有多种药理学活性。近年来类于TCS抗肿瘤的研究有较多进展,但就其抗肿瘤机制尚未达成共识。一种观点认为,TCS可以诱导肿瘤细胞凋亡;另一种观点认为,TCS可以作为核糖体活性抑制蛋白(ribosome inactivating protein,RIP)不可逆地抑制蛋白质合成,从而发挥抗肿瘤作用。本文就TCS的抗肿瘤机制加以综述。

天花粉蛋白突变体TCS_(KR173-174CG)的构建、表达与纯化

目的构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化。结果目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达。

根癌农杆菌介导天花粉蛋白基因TCS转化茎瘤芥的研究

以茎瘤芥(Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因导入到茎瘤芥中。对所获得的31株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为23株;Northern blot分析结果表明基因TCS在转基因植株中能够正常表达。转基因植株接种病毒试验结果表明,转基因TCS的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。

研究报告具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白TCS_(YFF-KR)的构建及原核表达

目的:构建具有抗HIV活性的突变型天花粉蛋白(TCS),并将其在原核系统内进行表达与纯化。方法:借助计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(YFF81-83和KR173-174),并依此设计适当的突变引物;以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增双突变型TCS全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western印迹鉴定;用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变型TCS蛋白进行纯化。结果:构建了突变型TCSYFF-KR,并获得了该蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化,产生大量均一的突变型TCS蛋白。结论:TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了一条新途径。

天花粉蛋白突变基因TCS_(A-S)转化烟草及其表达

以普通烟草品种K326和三生烟为外植体,通过根癌农杆菌介导将突变的栝楼天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因TCSA-S与Gus基因偶联转化烟草,在25mg/L的潮霉素的筛选条件下,K326和三生烟的转化率分别达到55.9%和72.4%;对转化体苗随机进行PCR扩增,均能扩增出长度为819bp的扩增片段;同时,X-Gluc的组织化学法染色,均能检测到Gus基因在转基因植株的根、茎、叶中表达,表明TCSA-S与Gus融合基因已转入到烟草的基因组中。

栝楼籽核糖体失活蛋白(TCK)与天花粉蛋白(TCS)性质比较研究

建立了从栝楼种籽大规模制备核糖体失活蛋白（ＴＣＫ）的方法。进行了ＴＣＫ与天花粉蛋白（ＴＣＳ）性质比较研究。

突变型天花粉蛋白TCS_(YFF81-83ACS)的生物活性及免疫原性分析

目的:构建一种突变型天花粉蛋白(trichosanthin,TCS),并对其生物活性和免疫原性进行分析。方法:选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83)进行定点突变,并将所构建的突变体(TCSYFF81-83ACS)在大肠杆菌中进行表达及纯化。随后与野生型TCS(wTCS)比较,分析其DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性和急性毒性。结果:初步检测显示,所构建的突变型TCS活性与wTCS活性几乎相当,而其免疫原性有所降低。结论:通过该方法改造TCS是可行的,有可能为抗HIV治疗提供一种高效、低毒、廉价的药物。

天花粉蛋白突变体TCS_(RL28-29CG)的构建、表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行N i-NTA层析纯化。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSRL28-29CG,并获得高效表达。

天花粉蛋白突变体TCS_(FYY163-165CSA)的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163-165),并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化。结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163-165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163-165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。

人肺癌单抗LC-1与天花粉毒蛋白(TCS)结合物的抗肿瘤作用

人肺癌单克隆抗体LC-1为IgM抗体。经ABC染色法证实它与人肺癌组织产生较高的阳性反应,并在人肺腺癌裸小鼠移植癌(LAX-83)中显像定位明显、清晰。本文报道LC-1与天花粉毒蛋白(TCS)经化学修饰,交联生成的结合物对LAX-83的抗肿癌效果。结合物LC-1.TCS的克分子比为1:3。用裸小鼠肾包膜检测法评价疗效,在裸小鼠双侧肾包膜下接种10～15omu(10omu=1mm)大小的癌块,于种后2d开始治疗,每天腹腔给药1次,连续给药7d,于停药后隔日解剖,测量瘤径,计算各组织块增殖大小,与对照组比较,求出各给药组肿瘤抑制率,经统计学处理后评价疗效。实验结果表明,LC-1或TCS单独治疗组以及两者混合物组对LAX-83均无明显疗效。

天花粉对2型糖尿病大鼠糖脂代谢和胰腺组织的影响

目的:探讨中药天花粉对高脂膳食和链脲佐菌素联合诱导的2型糖尿病大鼠的治疗作用及其可能的作用机制。方法:从60只雌雄各半的SD大鼠中随机抽取10只作为正常组,使用普通饲料喂养,剩余的50只大鼠使用高脂饲料喂养。4周后,腹腔注射链脲佐菌素(50 mg/kg),分别于注射后48 h、72 h测定大鼠空腹血糖,将连续2次空腹血糖≥16.7 mmol/L的大鼠确定为实验性糖尿病大鼠模型,根据血糖值将糖尿病大鼠随机分为模型组、二甲双胍组(0.3 mg/kg)、天花粉低剂量组(1.12 g/kg)、天花粉中剂量组(1.68 g/kg)和天花粉高剂量组(2.25 g/kg),每组10只。每天固定时间统一灌胃,持续4周,每周固定时间观察大鼠的一般症状,并测定其摄食量、摄水量、体质量和尿量。给药4周后,所有大鼠提前禁食不禁水12 h,尾静脉采血0.05 mL,测定大鼠空腹血糖,腹主动脉采血后处死大鼠并检测以下指标:各组大鼠的胰腺组织苏木精-伊红切片的病理改变,血清标本中的低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、三酰甘油、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等指标的含量。以免疫组化法检测胰腺组织中葡萄糖转运蛋白4的表达。结果:天花粉各给药组大鼠的空腹血糖浓度明显比模型组低(P<0.01或P<0.05);苏木精-伊红染色结果表明,天花粉能够在一定程度上抑制各组2型糖尿病大鼠胰腺组织的病理学改变;天花粉能够显著提升糖尿病大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量,并降低三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平(P<0.05);天花粉给药组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶表达量明显降低(P<0.05);天花粉能上调糖尿病大鼠胰腺组织中葡萄糖转运蛋白4的水平(P<0.05)。结论:天花粉能够改善2型糖尿病大鼠的糖脂代谢,保护胰腺及重要脏器,其作用机制可能与其激活机体的葡萄糖转运蛋白4通路有关。

亚天花粉蛋白突变体R163Kn-TCS及其复合物R163Kn-TCS/Ade的晶体结构

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ的晶体， 并用ＡＭＰ 浸泡４８ 小时后得到复合物晶体。在Ｍａｒ－ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 面探测器系统上分别收集了０ ．２０５ 和０ ．１８７ｎ ｍ 分辨率的Ｘ－ 射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构，用Ｘ－ ＰＬＯＲ 软件包进行修正，最后两模型的偏差因子（Ｒ 和Ｒｆｒｅｅ） 分别为（０．１８７ 和０．２６３） 和（０．１８０ 和０．２３３） ，键长偏差都为０ ．００１３ｎｍ ， 键角偏差分别为２ ．７０８°和２ ．５８４°。结构测定显示Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ 和Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ／Ａｄｅ 的主链结构无较大变化活性口袋区的结构和氢键体系发生了明显变化。生化分析表明Ｒ１６３Ｋ ｎ － ＴＣＳ 具有糖苷酶活性，但活性降低。这说明，第１６３ 位侧链的Ｈ＋ 对ｎ － ＴＣＳ发挥Ｎ－ 糖苷酶活性至关重要。

亚天花粉蛋白突变体(R163H n-TCS和R163Q n-TCS)的晶体结构研究

用悬滴汽相扩散法得到了Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ６１３Ｑｎ－ＴＣＳ的晶体，在Ｍａｒ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ面探测器系统上分别收集了０．２００和０．２０５ｎｍ分辨率的Ｘ－射线衍射数据。采用同晶差值傅立叶法解析结构，用Ｘ－ＰＬＯＲ软件包进行修正，最后的晶体学Ｒ因子分别为０．１８４和０．１８５，键长偏差分别为０．００１３ｎｍ和０．００１４ｎｍ，键角偏差分别为２．５９０°和２．８１５°。结构测定显示Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ和Ｒ１６３Ｑｎ－ＴＣＳ与ｎ－ＴＣＳ的主链结构无较大变化，活性口袋区的结构和氢键体系发生了明显变化。生化分析表明Ｒ１６３Ｈｎ－ＴＣＳ具有糖苷酶活性，Ｒ１６３Ｑｎ－ＴＣＳ没有糖苷酶活性。这说明，第１６３位侧链的Ｈ＋对ｎ－ＴＣＳ发挥Ｎ－糖苷酶活性至关重要。

天花粉蛋白突变基因TCS_(A-S)在大肠杆菌BL21中的表达

天花粉蛋白是具有N-糖苷酶活性的一种植物Ⅰ型核糖体失活蛋白,本研究用PCR方法获得了天花粉蛋白的突变基因TCSA-S,构建了表达载体pET-30a(+)-TCSA-S,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在30℃条件下诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测,重组的突变体基因TCSA-S表达产物主要存在于包含体中。

天花粉蛋白衍生物的研究进展

天花粉蛋白是从栝楼块根中提取出的一种单链核糖体灭活蛋白,临床上用于异位妊娠、葡萄胎等疾病的治疗,但天花粉蛋白具有免疫原性、细胞穿透不足等缺点,妨碍天花粉蛋白进一步的科技转化和临床应用。因此,运用各种方法修饰或改造天花粉蛋白具有重要的研究意义。近年来对天花粉蛋白进行了突变重组、蛋白融合、聚乙二醇化、纳米颗粒封装等修饰改造,不同程度地降低天花粉蛋白的不良反应,延长半衰期、提升肿瘤内的渗透性和靶向性,可在保持甚至提高天花粉蛋白生物效应的同时降低其副作用,随着融合蛋白结合纳米递送技术的发展和完善,天花粉蛋白在抗肿瘤、器官移植等领域有着巨大的应用潜力。本文对各种修饰改造手段及作用机制进行综述,以期为天花粉蛋白的临床应用提供依据。

天花粉蛋白通过激活CD8Tc2亚群诱导人体免疫抑制

为了探讨天花粉蛋白(Tk)诱导免疫抑制的机制,采用抗原非特异性T淋巴母细胞增殖系统,筛选了37个Tk致敏的抑制性T细胞系。分析表明,健康人体内Tk相关抑制性T细胞的频率为5.0×10-7～10.8×10-7,该细胞系属CD8+TCRαβ+,细胞因子表达格局呈现向IL-4和IL-10明显偏移和IFN-γ分泌明显下降的格局。结合我们已有关于CD8+T细胞介导Tk相关应答而不显示细胞毒性的工作,可从表型和功能分析上确认,Tk针对体外人体淋巴细胞增值的免疫抑制,由CD8Tc2细胞介导。

天花粉蛋白诱导小鼠Th2/Tc2亚群分化与MHC背景相关

为阐明天花粉蛋白 (Tk )诱导免疫抑制和基因调控的机制 ,应用ELISA方法动态测定小鼠OVA特异性T淋巴细胞培养上清液中T细胞亚群相关细胞因子的含量 ,观察Tk对高、低易感品系小鼠T细胞分泌细胞因子格局的影响。发现Tk作用下 ,高易感品系C5 7BL/ 6 (H 2 b)IL 4、IL 10分泌量大幅度增高 ,IFN γ显著下降 ;而低易感品系C3H/He (H 2 k)相应的细胞因子变化极小。上述结果表明 :(1)Tk可诱导功能性T细胞亚群向Th2 /Tc2方向分化 ,并导致OVA特异性T细胞增殖受抑 ;(2 )T细胞亚群分化与MHC背景密切相关。

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞顺铂化疗增敏作用

目的观察天花粉(TCS)联合顺铂对宫颈癌HeLa细胞的化学治疗(化疗)增敏作用,并探讨其作用机制。方法细胞计数检测试剂盒(CCK8)法检测TCS、顺铂单独或联合用药对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响;CompuSyn软件分析TCS联合顺铂的联合用药指数(CI值);细胞划痕实验与Transwell法检测药物对细胞迁移的影响;流式细胞术检测药物对细胞凋亡的影响;蛋白印迹法检测药物对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响。结果TCS与顺铂均能抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,TCS+顺铂抑制作用更强,TCS对顺铂增敏指数为3.04;不同浓度TCS联合顺铂作用HeLa细胞48 h后,CI值均<1,且具有浓度依赖性(P<0.05);细胞划痕实验与Transwell法实验中,TCS+顺铂较TCS或顺铂单独给药能更明显抑制HeLa细胞迁移(P<0.05);流式细胞术中,与TCS或顺铂单独给药相比,TCS+顺铂可增加HeLa细胞凋亡比例(P<0.05);蛋白印迹实验中,与TCS或顺铂相比,TCS+顺铂可上调促凋亡蛋白Bax、c-PARP表达,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达(P<0.05)。结论TCS+顺铂对抑制宫颈癌HeLa细胞生长具有协同效应,TCS对顺铂化疗有增敏作用,其机制可能与TCS联用后促进HeLa细胞凋亡及抑制细胞迁移有关。

天花粉蛋白及其肽段诱导的免疫抑制依赖APC表面Notch配体的表达

新近发现,Notch信号途径参与调节外周成熟T细胞及其亚群的分化和功能发挥。本研究应用天花粉蛋白及其衍生肽处理骨髓来源的小鼠树突状细胞(DC),检测Notch配体家族分子的表达及DC对CD8+T细胞分泌细胞因子的影响。结果表明,天花粉蛋白或其衍生肽PB处理DC可使Notch配体Jagged1、Delta1分子表达明显增加,并改变CD8+T细胞细胞因子分泌格局,明显抑制Th1相关细胞因子IFN-γ的分泌,而Th2相关细胞因子IL-4和IL-10分泌明显增加。Notch信号的阻断剂可以部分逆转Tk及肽段的抑制作用。表明天花粉蛋白及其衍生肽可诱导一群具有抑制能力的CD8+T细胞,该作用依赖于DC表面Notch配体的表达。

用天花粉蛋白基因转化小麦获得转基因植株

取普通小麦品种京411未成熟胚诱导愈伤组织，10天左右，对820个胚性愈伤组织用含有35S启动子的天花粉蛋白（trichosanthin, TCS）基因轰击。2周后，将这些被轰击的愈伤组织转到含潮霉素50mg/L的筛选培养基上，经分化和生根，获得了33棵再生植株，经接饲毒蚜虫抗病性鉴定和PCR、Southern杂交分析，从中筛选出4株含有编码TCS的转基因小麦植株。转化频率为0.49%。