液晶传感竞争免疫法检测天蚕素B

制备了一种基于液晶取向变化的非标记液晶型免疫传感器,并结合竞争免疫反应原理,将其用于天蚕素B检测.首先采用硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷/二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(APTES/DMOAP)混合自组装构建可诱导液晶分子呈均一垂直排列的基底敏感膜,再通过戊二醛交联法将天蚕素B固定到基底表面,当天蚕素B抗体与天蚕素B特异性结合后扰乱了液晶分子的取向,使液晶膜的颜色和亮度发生变化,并通过计算偏光显微镜成像灰度强度,可在0.01~0.1ng/mL范围内定量化分析天蚕素B浓度.结果表明,固定化天蚕素B浓度为150ng/mL,天蚕素B抗体浓度为500ng/mL时,天蚕素B检测限可达0.01ng/mL.本方法具有灵敏度高、特异性好、非标记和操作简单等优点.

银纳米粒子信号放大检测天蚕素B的研究

利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(ATPES)和N,N-二甲基十八烷基(3-三甲氧基硅丙基)氯化铵(DMOAP),对玻片基底表面进行烷基化修饰,再通过戊二醛(GA)作为桥联,将经过银纳米粒子(AgNPs)修饰的天蚕素B抗体(anti-CB)固定在玻片基底上,构建新型液晶生物传感器。当存在天蚕素B(CB)时,其可与anti-CB发生特异性免疫反应,从而固定在玻片基底表面。利用AgNPs具有较大的比表面积和良好的生物相容性,可以使得AgNPs周围的液晶分子垂直排列被极大地扰乱,从而起到局部光学信号放大的作用,达到检测更低浓度CB的目的。通过对CB浓度与其对应的图像灰度值之间的线性拟合发现,CB浓度在10~100 ng/mL之间时,CB浓度与其对应图像灰度值之间存在线性关系。实验结果表明,采用AgNPs对CB进行信号放大,其检出限可以低至1.02 ng/mL。

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。

抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达

利用绿色荧光蛋白 (GFP)基因与天蚕素 B突变体 ABP- S1基因的融合基因 ,构建了 2个原核表达载体 p Am GS1和 p Bm GS1,转化表达宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3)和 E.coli BL 2 1(DE3) p L ys S。结果 ,p Am GS1未能得到转化子 ,而p Bm GS1的转化子高效表达了融合蛋白 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检查 ,融合表达产物最高可占菌体总蛋白的49.45 %。表达产物经包涵体复性 ,柱层析初步纯化 ,通过平板抑菌试验 ,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌以及鱼类重要的致病菌嗜水气单胞菌等多种革兰氏阳性。

天蚕素B串联体在紫花苜蓿中的表达

根据植物偏好性密码子进行改造获得了天蚕素B基因,又通过同尾酶连接获得2个和3个天蚕素B基因的串联体,分别构建植物表达载体,并采用农杆菌介导的方法转化紫花苜蓿。对转基因植物进行分子生物学检测,结果表明CB、CB2、CB3三个基因成功整合到了苜蓿基因组中,转基因植物总蛋白活性检测表明转CB、CB2、CB3基因的蛋白均有一定的抑菌活性,但串联CB3基因的抑菌活性最强。

抗菌肽天蚕素B基因在纳豆芽胞杆菌中的表达

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的小分子多肽。天蚕素B(Cecropin B)是最早从天蚕体内分离得到的一种热稳定的可溶性多肽,在已分离的众多抗菌肽中抗性较强。纳豆芽胞杆菌具有优良的益生特性,本研究选择枯草芽胞杆菌的一种表达载体p HT43,将抗菌肽天蚕素B基因导入纳豆芽胞杆菌中,验证其在目的菌中是否能够表达和稳定传代以及进行抗菌活性分析。结果表明,天蚕素B基因在纳豆芽胞杆菌中表达,并能稳定传代,能够提高纳豆芽胞杆菌的抑菌活性,抗金黄色葡萄球菌的活性优于干酪乳杆菌和枯草芽胞杆菌。本研究为该重组菌作为饲料添加剂的应用提供了技术基础。本文首次报道天蚕素B在纳豆枯草芽胞杆菌中表达。

液晶型非标记免疫传感器检测天蚕素B

制备了一种基于液晶取向变化的非标记液晶型免疫传感器,用于检测天蚕素B。首先采用硅烷化试剂自组装膜法构建基底敏感膜诱导液晶分子呈均一垂直排列,再通过戊二醛交联法将天蚕素B固定到基底表面,当天蚕素B抗体与天蚕素B特异性结合后扰乱了液晶分子的取向,使液晶膜的颜色和亮度发生变化,以此实现对天蚕素B的检测,检测限可达0.1 ng/m L。本方法具有灵敏度高、特异性好、非标记和操作简单等优点。

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。

抗菌肽天蚕素B对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌作用

目的观察抗菌肽天蚕素B对小鼠铜绿假单胞菌感染创面的抗菌效果。方法于30只ICR小鼠背部切除全层皮肤(创面为1 cm×1 cm),将铜绿假单胞菌菌液涂抹于创面制成感染模型,并随机分为对照组、磺胺米隆组、抗菌肽组,伤后3 h分别用含等渗盐水、100 g／L磺胺米隆溶液、1g／L天蚕素B的纱布湿敷,每组10只。伤后1～4 d对各组小鼠创面行大体观察;伤前和伤后4 d测量体温,抽取血液观察白细胞变化;伤后4 d检测痂下肌肉组织细菌定量和观察存活情况。结果对照组创面分泌物多、创面潮湿;磺胺米隆组、抗菌肽组创面结痂、干燥、无明显分泌物。各组小鼠术后体温多数上升、白细胞计数均减少。抗菌肽组痂下肌肉组织细菌定量为(42±50)集落形成单位(CFU)／g,明显少于磺胺米隆组(886±804)CFU／g(P<0．05),两组均明显低于对照组(41±28)×105CFU／g(P<0．01)。对照组小鼠伤后4 d存活数明显少于抗菌肽组、磺胺米隆组(P<0．05)。结论天蚕素B对ICR小鼠铜绿假单胞菌感染创面有明显的抗感染作用,可明显降低其死亡率。

天蚕抗菌肽B在毕赤酵母中的表达

Cecropins B是一种昆虫抗菌肽,具有分子量小,热稳定性、水溶性好、抗菌谱广等优点,更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。根据毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,改造并化学合成天蚕素基因B,克隆到pPIC9K载体中,构建分泌型重组酵母表达载体CB-pPIC9K,转化Pichia pastoris受体菌KM71,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,Cecropin B获得表达,分子量约3.8KD,摇瓶发酵产率可达到200μg/mL,并对其抗菌活性进行了初步测定。结果表明我们表达的重组Cecropins B对G-菌有较好的抑菌活性,且具有较好的热稳定性。这些特点使得重组抗菌肽Cecropins B在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。

天蚕抗菌肽B基因在毕赤酵母中多拷贝表达载体的构建

根据BglII和BamHI同尾酶的特点,通过对pPIC9K/CB进行改造,获得了不含BamHI位点的CecropinB表达框,并在此基础上构建了含三拷贝Cecropin B表达框的毕赤酵母表达载体,为Cecropin B的进一步开发与应用打下了基础。

逆转录病毒介导的天蚕抗菌肽B在奶牛乳腺中的表达

为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织长期表达的可行性以及对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列以哺乳动物偏爱的密码子优化后,合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法获得了天蚕抗菌肽B的基因,将其亚克隆至T载体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX-bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上。

免标记电化学发光免疫法传感器检测饲料中抗菌肽

构建了测定抗菌肽的免标记电化学发光免疫传感器。采用循环伏安法在金电极表面电聚合L-半胱氨酸（Cys）层,然后采用滴加的方式,通过Au-S共价和静电吸附作用再修饰纳米金颗粒于Cys层,进一步通过静电吸附作用固定抗菌肽抗体（例如天蚕素B抗体）,最后以牛血清白蛋白封闭非特异性吸附位点,制得目标传感器。将目标传感器在含有天蚕素B的溶液中于37℃温育1.5 h,由于抗原与目标传感器上的抗体会发生特异性的免疫反应,产生的免疫复合物会导致0.1 mol/L K2S2O8-0.1 mol/L PBS体系的ECL降低。在优化的条件下,天蚕素B在0.1-10 ng/m L范围内,ECL和天蚕素B质量浓度对数呈线性关系,线性方程为y=1352.0-520.54lgρ,r=0.996,检出限为30 pg/m L（S/N=3）。