硒化天麻多糖的制备、结构表征及其抗氧化活性评价

本文以天麻多糖(Gastrodia elata Blume polysaccharides,GEP)和亚硒酸钠为原料,以硒含量为指标,利用单因素实验和响应面试验优化硝酸-亚硒酸钠(HNO_(3)-Na_(2)SeO_(3))法制备硒化天麻多糖(Selenated Gastrodia elata polysaccharides,SeGEP)的工艺。采用紫外光谱、红外光谱、核磁共振、粒径和Zeta电位、刚果红试验、碘-碘化钾试验、扫描电镜等对GEP和SeGEP进行结构表征分析;并采用体外抗氧化活性试验研究硒化修饰对天麻多糖的活性影响。结果表明,硒化天麻多糖最佳制备工艺条件为:反应温度74℃、硝酸浓度0.041%、反应时间8.4 h,在此条件下SeGEP的硒含量为3891.05±10.86μg/g;结构表征结果显示天麻多糖被成功硒化修饰,硒化修饰后可使GEP粒径降低、Zeta电位的绝对值变大、多糖溶液的稳定性改善,同时发现GEP和SeGEP可能具备三股螺旋结构,且含有较长的侧链和支链结构;扫描电镜分析显示硒化修饰可改变GEP的微观形态。体外抗氧化活性实验表明,在浓度为10 mg/mL时,SeGEP对DPPH自由基清除率为98%±1.52%、最大铁还原力为0.99±0.24,在浓度为1 mg/mL时SeGEP对ABTS+自由基清除率为97.49%±1.16%,均比天麻多糖高,表明硒化修饰可提高天麻多糖抗氧化能力。本研究可为硒化天麻多糖相关的补硒制剂、功能食品开发提供理论基础。

不同pH值溶剂对昭通乌天麻多糖提取率及抗氧化能力研究

以昭通乌天麻为研究对象,考查不同pH值提取液和不同浓度醇沉液对天麻粗多糖提取率的影响,并对初多糖进行分离纯化,考查其对羟自由基、DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)的抑制率,评价天麻多糖的抗氧化能力。结果表明,提取液pH值为4时天麻粗多糖提取率最高,为23.6%;当其质量浓度为0.2 mg/m L时对羟基自由基的抑制效果达75.61%,清除效果较好。pH值为4的条件下,85%乙醇醇沉所得多糖对羟基自由基的抑制效果最好,醇沉液体积分数为75%时,多糖对DPPH自由基的抑制率最高。不同pH值条件下提取的天麻粗多糖进行分离纯化后抗氧化能力有一定差异性,pH值为4条件下提取的天麻粗多糖分离纯化后的组分,抗氧化能力优于其他组。酸性条件下,无论是粗多糖还是分离出的多糖组分,其羟基自由基抑制率和DPPH自由基抑制率均高于碱性提取液所提取的多糖组。研究表明,选择合适pH值的提取液更有利于高活性天麻多糖的制备。

基于非对称场流分离技术分离表征天麻多糖:空间位阻转变效应

采用非对称场流分离(AF4)在线联用多角度光散射(MALS)检测器和示差折光(dRI)检测器(AF4-MALS-dRI)对天麻多糖(GEPs)的相对分子质量(M)、回转半径(Rg)和构象进行了表征。GEPs粒径分布较宽,在AF4分离过程中存在空间位阻转变效应,导致粒径大小不同的GEPs分子被同时洗脱,无法准确表征其M、Rg分布和构象。本文研究了恒定交叉流流速、指数衰减交叉流流速、样品质量浓度和垫片高度对空间位阻转变效应的影响。结果表明,较高的样品质量浓度会导致空间位阻转变现象的发生;垫片高度会影响样品的分离度和保留时间,改变空间位阻转变点(di);对于多分散GEPs样品,指数衰减交叉流流速不仅能调整di,而且能改善样品的分离度,缩短分析时间。在样品质量浓度为0.50 mg/mL、进样体积为50μL、检测器流速为1.0 mL/min、垫片高度为350μm、初始交叉流流速由0.2 mL/min呈指数衰减至0.05 mL/min、半衰期为2 min的条件下,解决了AF4分离GEPs时存在的空间位阻转变效应问题。此外,在最佳洗脱条件下研究了不同产地及不同超声时间对GEPs的M、Rg和构象的影响。结果表明,随着超声时间的增加,云南和四川产地GEPs的Rg和M均减小,分布变窄;当超声时间为15 min时,云南产地GEPs为松散的高度支化构象,四川产地GEPs为球状构象;当超声时间增加到30 min或60 min时,两产地GEPs的构象主要为高度支化结构,表明GEPs发生了降解。实验结果证明,在最佳洗脱条件下,AF4-MALS-dRI对GEPs的表征具有良好的重复性,GEPs的Rg和M相对标准偏差分别为0.5%和1.7%。

天麻多糖对阿尔茨海默症小鼠焦虑行为及记忆功能的影响

目的构建D-半乳糖(D-gal)联合三氯化铝(AlCl 3)致阿尔茨海默病(AD)小鼠模型,探讨天麻多糖(GEP)对AD小鼠焦虑行为及条件恐惧记忆能力的影响。方法采用皮下注射D-gal(60 mg/kg)联合灌胃AlCl 3(5 mg/kg)构建AD小鼠模型,给予小鼠GEP(50、100、150 mg/kg)进行干预。AD小鼠分别于给药第7、18天进行高架十字迷宫实验(EPMT)、旷场实验(OFT)和恐惧箱实验(FCT),评价GEP对AD小鼠焦虑行为和条件暗示性记忆能力的改善作用。结果与空白组相比,模型组小鼠进入高架十字迷宫开臂的时间比(P<0.001)和次数比显著减少(P<0.01),在旷场实验中心区运动距离减少(P<0.05),活动时间缩短(P<0.01);分别给予GEP 50、100、150 mg/kg后,AD小鼠进入高架十字迷宫开臂的时间比(P<0.001)和次数比(P<0.01)增加,进入旷场实验中心区的活动时间延长,且运动距离增加(P<0.05),提示GEP可改善AD小鼠的焦虑样行为。恐惧箱实验结果显示,与空白组相比,模型组小鼠在恐惧箱内的僵直时间和僵直次数增加(P<0.001)。与模型组相比,GEP减少AD小鼠在恐惧箱内的僵直时间和次数(P<0.001),且呈剂量依赖性,提示GEP能改善AD小鼠的学习记忆能力。结论GEP能改善AD模型小鼠的焦虑行为和记忆功能,但其具体作用机制尚待进一步研究。

酶解法提取天麻多糖的研究

目的:研究复合酶提取天麻多糖的最佳工艺。方法:采用单因素试验和正交试验设计进行优选,考察酶用量、pH值、反应时间和反应温度对天麻多糖的影响。结果:提取天麻多糖的最佳工艺为温度50℃,加热时间60min,酶用量20 mg,pH值为4,天麻多糖得率为2.48%。结论:酶解法提取天麻多糖提取工艺简便,经济环保,含量明显优于传统工艺。

天麻多糖通过影响小鼠免疫系统抑制肿瘤生长

目的研究天麻多糖对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响及其对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。方法 MTT法检测不同质量浓度的天麻多糖对小鼠肝癌H22细胞体外增殖的影响;健康小鼠和接种H22瘤株造模昆明种小鼠分成7组(n=12):对照组(0.9%NaCl溶液2 ml),模型组(0.9%NaCl溶液2 ml),环磷酰胺(20 mg·kg-1)组,天麻多糖低、中、高剂量(30、60、90 mg·kg-1)组,观察天麻多糖对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用。结果天麻多糖对肝癌H22细胞增殖有显著的抑制作用。且在小鼠体内能明显抑制对H22肿瘤瘤体生长,高剂量(90 mg·kg-1)效果明显(P<0.05);环磷酰胺和天麻多糖合用可使环磷酰胺对白细胞计数、胸腺指数和脾指数的影响降低。结论天麻多糖能抑制肝癌H22细胞的增殖,与环磷酰胺联用可降低环磷酰胺对免疫系统的伤害。

天麻多糖水提取工艺优化研究

研究了天麻多糖提取工艺中提取时间、提取温度、料水比对天麻多糖提取率的影响，并对这3个工艺参数进行了优化。结果表明，提取温度、提取时间和料水比对天麻多糖提取率的影响程度都达到高度显著水平。SAS软件处理数据得二次回归方程为：Y=9273＋0.488X1＋0.308X2＋0.185X3-0.495X1^2-0373X2^2-0211X2^2＋0．004X1X2-0．024X1X3-0．016X2X3。响应曲面分析结果表明，水法提取天麻多糖的最佳工艺条件为：提取温度为58℃，提取时间36min．料水比1：37．

天麻多糖与蜜环菌多糖抗眩晕症作用研究

目的研究天麻多糖(GEP)与蜜环菌多糖(AMP)抗眩晕症效果。方法由机械旋转使小鼠产生眩晕后,通过迷宫实验与跳台实验测定各组眩晕小鼠逃避电击所用时间,并观察眩晕小鼠的进食量。结果GEP与AMP活性相似,均能显著缩短眩晕小鼠逃避电击所用的时间(P<0.01),增加眩晕后小鼠的进食量。结论GEP与AMP对机械旋转所致眩晕症均具有一定疗效。

天麻多糖的分离及其单糖组成分析

从天麻中提取分离天麻多糖(GBP-Ⅰ,GBP-Ⅱ),并对其组成进行研究。天麻依次经热水浸提,乙醇沉淀,Sevag法除蛋白质,有机溶剂洗涤、超滤,得天麻多糖GBP-Ⅰ和GBP-Ⅱ,将GBP-Ⅰ和GBP-Ⅱ分别用1mol/L的盐酸在100℃水解,水解液经过离子色谱分析,确定其单糖组成的种类和比例。GBP-Ⅰ和GBP-Ⅱ两种多糖均由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成。其中GBP-I中5种单糖的相对含量分别是1.27%、5.41%、76.49%、6.32%、10.51%,GBP-Ⅱ中5种单糖的相对含量分别是2.32%、8.49%、62.44%、10.22%、16.53%。

天麻多糖对皮质酮损伤PC12细胞保护机制研究

目的:研究天麻多糖(polysaccharides from Gastrodia elata,GEP)对皮质酮(corticosterone,Cort)诱导的PC12细胞损伤起保护作用的分子机制。方法:GEP各剂量(0、250、500、1000μg/mL)与Cort 200μmol/L共孵PC12细胞48 h,Fura-2/AM荧光标记法测定细胞内Ca2+浓度的变化;Western blotting法检测细胞内BCL-2、BAX及Caspase-3蛋白的表达。结果:200μmol/L Cort处理PC12细胞后,细胞存活率较正常对照组显著降低,胞内[Ca2+]i升高,BCL-2蛋白表达量降低,BAX蛋白表达量升高;GEP各剂量均能明显改善细胞形态,并呈浓度依赖性使细胞内[Ca2+]i降低,BCL-2蛋白表达量提高,BAX蛋白表达量减少,Caspase-3蛋白表达受到抑制。结论:GEP对Cort损伤的PC12细胞的保护作用机制可能与抑制细胞内Ca2+浓度超载,调节BCL-2/BAX比值,及抑制Caspase通路有关。

不同精制方法对天麻多糖抗氧化活性的影响

目的探索不同精制方法对天麻多糖抗氧化活性的影响。方法以天麻粗多糖为材料,对比研究了盐析-透析法和Sevag法精制天麻粗多糖的方法,并对比了天麻粗多糖与两种方法精制天麻多糖清除羟自由基(-OH)的能力。结果 Sevag法精制天麻多糖抗氧化活性最低(IC50为11.78 mg/mL),盐析-透析法精制天麻多糖抗氧化活性最高(IC50为3.20 mg/mL),未精制天麻粗多糖抗氧化活性居中(IC50为4.69 mg/mL)。结论盐析-透析法可显著提高天麻粗多糖的抗氧化活性(约提高活性50%)。

天麻多糖对皮质酮诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的:研究天麻多糖(polysaccharides from gastrodia elata blume,GEP)对皮质酮(corticosterone,CORT)诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:采用水提醇沉法提取,经Sevag法脱蛋白及透析处理制得GEP。将培养好的细胞分为正常对照组、模型组(200μmol·L^(-1) CORT)和GEP高(1 000μg·ml^(-1))、中(500μg·ml^(-1))、低(250μg·ml^(-1))剂量组。GEP与CORT共孵PC12细胞48 h后,采用MTT比色法判断细胞损伤的程度;化学比色法测定乳酸脱氢酶的释放量;倒置显微镜和DAPI荧光染色法观察PC12细胞凋亡形态。结果:与正常对照组相比,模型组细胞存活率显著降低(P<0.01),LDH释放量增加,且凋亡细胞增多。当给予GEP后,各剂量组均能显著降低LDH释放量,细胞存活率增加,凋亡细胞显著减少(P<0.01)。结论:GEP对皮质酮诱导PC12细胞损伤具有一定的保护作用,为GEP的临床应用提供试验依据。

天麻多糖GEP-2对BCG+LPS致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的:观察天麻多糖GEP-2对卡介苗加脂多糖(BCG+LPS)致小鼠免疫性肝损伤的影响。方法:制备BCG+LPS致小鼠免疫性肝损伤模型,比色法测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量,肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度以及谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)活力,酶联免疫法测定血清TNF-α、IL-1的含量,用MTT法测定脾T、B淋巴细胞增殖能力。结果:天麻多糖GEP-2(25、50、100mg/kg)能明显降低小鼠血清中升高的ALT和AST水平以及TNF-α、IL-1的含量,抑制肝脏中上升的MDA水平和提高过低的SOD、GSH-Px活性,且各用药组均能提升脾T、B淋巴细胞增殖能力。结论:天麻多糖GEP-2对BCG+LPS致小鼠免疫性肝损伤具有显著的保护作用。

天麻多糖的抗衰老作用

目的研究天麻多糖对D-半乳糖致衰老小鼠生理机能的影响。方法实验小鼠随机分为5组,分别为正常对照组,模型组,天麻多糖低、中、高剂量〔2.5、5.0、10.0mg/(g.d)〕组。在给药8周后,用Morris水迷宫分别测试小鼠的学习记忆能力;测定小鼠的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和单胺氧化酶等酶活性及丙二醛含量;用透射电镜观察各组小鼠的脑组织形态学变化。结果天麻多糖中、高剂量组可显著提高衰老小鼠在Morris水迷宫的逃避潜伏期,高剂量治疗组可明显促进脑组织神经元恢复,显著提高衰老小鼠脑内超氧化物歧化酶、血液中谷胱甘肽过氧化物酶活性;抑制脑内单胺氧化酶活性;降低脑组织中丙二醛水平。结论天麻多糖可改善D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力,促进脑神经的恢复;显著改善机体氧化代谢相关酶的活性,具有一定的抗氧化活性。初步确定天麻多糖为天麻抗氧化、延缓衰老的活性成分。

电针联合天麻多糖对脑缺血大鼠海马CA3区Nesin、BDNF表达的影响

目的观察电针联合天麻多糖对脑缺血大鼠海马CA3区巢蛋白(Nestin)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达的影响。方法将40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组、天麻多糖组和针药结合组,每组8只。以单侧大脑中动脉栓塞法制备脑缺血模型。造模后2w,天麻多糖组和针药结合组大鼠给予天麻多糖100mg/kg灌胃,每天1次,连续2w;电针组和针药结合组大鼠给予"百会""足三里"穴电针刺激,持续30min,每天1次,连续2w。采用免疫组织化学染色法结合图像分析检测海马CA3区Nestin和BDNF的表达。结果与正常对照组比较,模型组缺血侧海马CA3区Nestin和BDNF阳性表达增加(P<0.05);与模型组比较,电针组、天麻多糖组和针药结合组缺血侧海马CA3区Nestin和BDNF阳性表达显著增加(P<0.05);针药结合组阳性表达显著多于电针组或天麻多糖组(P<0.05)。结论电针与天麻多糖结合可显著增加脑缺血大鼠缺血侧海马CA3区Nestin和BDNF的表达,促进内源性神经干细胞激活,且作用优于单用电针或天麻多糖。

天麻多糖结合电针抑制脑缺血大鼠Meynert基底核神经元损伤和上调BDNF、SCF及VEGF表达

目的观察脑缺血后Meynert基底核BDNF、SCF及VEGF等的表达,比较分析天麻多糖(gastrodia elata polysaccharide,GEP))结合电针(electroacupuncture,EA)或单独应用对其干预效果,探讨针药结合对脑缺血的神经血管保护机制。方法将雄性SD大鼠40只随机分成空白对照组、脑缺血模型组、天麻多糖组、电针组及针药结合组,每组8只。采用单侧大脑中动脉线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。模型制备成功后,天麻多糖组大鼠每日给予天麻多糖100mg/kg灌胃1次,连续2周;电针组大鼠每日电针刺激"百会"、"足三里"穴1次,每次30min,连续2周;针药结合组每日电针刺激"百会"、"足三里"穴1次,每次30min,同时给予天麻多糖100mg/kg灌胃1次,连续2周。尼氏染色法观察各组大鼠Meynert基底核神经细胞形态及存活数,免疫组织化学方法检测各组大鼠Meynert基底核BDNF、SCF及VEGF蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠缺血侧Meynert基底核神经细胞存活数显著减少,BDNF、SCF及VEGF免疫染色显著增强;与模型组比较,天麻多糖组、电针组及针药结合组大鼠缺血侧Meynert基底核神经细胞存活数显著增加,BDNF、SCF及VEGF免疫染色显著增强;针药结合组与天麻多糖组、电针组比较,缺血侧Meynert基底核神经细胞存活数显著增加,BDNF、SCF及VEGF免疫染色也增强。结论脑缺血后Meynert基底核神经血管相关因子表达增加,提示Meynert基底核是脑缺血后易损区域之一;天麻多糖结合电针可上调BDNF、SCF及VEGF表达,对Meynert基底核起到神经的保护作用,且作用优于天麻多糖或电针的单独应用。

天麻多糖的降血压作用

目的从天麻中提取出天麻多糖(PGB),研究PGB对高血压模型大鼠的降血压作用。方法水提醇沉法提取出天麻粗多糖,DEAE-52纤维素柱分离纯化得PGB。用两肾一夹(2K1C)方法制作高血压模型(RHR)大鼠,以卡托普利(10mg/kg·d)为阳性对照组,以服用自来水为阴性对照组,以天麻多糖低、中、高3个浓度(50、100、200mg/kg·d)给药30d后测定大鼠心率与血压的变化,尿量的变化,以及血清中一氧化氮(NO)、血浆内皮素(ET)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的变化。结果天麻多糖PGB能明显降低RHR大鼠的收缩压和舒张压(P<0·05),尤其是中、高剂量组(P<0·01),并且在剂量范围内呈剂量依赖性;对大鼠心率及尿量没有明显作用;血清NO含量(51·9±9·8vs对照组40·7±10·2)μmol/L,血浆ET含量下降(164±25vs对照组209±10)μmol/L,AngⅡ含量下降(247±20vs对照组310±37)μmol/L,P值均<0·01。结论天麻多糖对RHR大鼠具有良好的降压作用,其作用机制与促进内源性舒血管物质的生成及抑制内源性缩血管物质的释放,最终恢复二者拮抗效应的平衡有关。

天麻多糖的超声波提取工艺研究

为了进一步开发利用天麻多糖,采用超声波提取法从天麻中提取天麻多糖,在单因素试验的基础上,用响应曲面法建立超声提取的二次响应曲面方程,考察了提取温度、提取时间和料水比对天麻多糖超声提取的影响。结果表明,超声波提取法可使天麻多糖提取率得到较大提高,其最佳提取工艺条件为:提取温度66℃,提取时间34 min,料水比1:45,在此工艺条件下,天麻多糖提取率为32．78％。

天麻多糖与电针对脑缺血大鼠齿状回BDNF和VEGF表达的影响

目的:观察天麻多糖与电针对脑缺血大鼠齿状回(dentate gyrus,DG)脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:将40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、电针组、天麻多糖组和针药结合组,每组8只。以单侧大脑中动脉栓塞法制备脑缺血模型。造模后2周,天麻多糖组和针药结合组大鼠给予天麻多糖100mg/kg灌胃,每天1次,连续2周;电针组和针药结合组大鼠给予"百会"、"足三里"穴电针刺激,持续30min,每天1次,连续2周。采用免疫组织化学染色法结合图像分析检测DG BDNF和VEGF的表达。结果:与正常对照组比较,模型组缺血侧DG BDNF和VEGF阳性表达增加(P<0.05);与模型组比较,电针组、天麻多糖组和针药结合组缺血侧DG BDNF和VEGF阳性表达明显增加(P<0.05);针药结合组阳性表达显著多于电针组或天麻多糖组(P<0.01)。结论:天麻多糖与电针结合可显著增加脑缺血大鼠缺血侧DG BDNF和VEGF的表达,促进内源性神经干细胞激活,且作用优于单用电针或天麻多糖。

天麻多糖-2对小鼠四氯化碳肝损伤和酒精肝损伤的保护作用

目的观察天麻多糖(GEP)-2对小鼠四氯化碳(CCl4)肝损伤和酒精肝损伤的影响。方法分别采用CCl4和北京红星二锅头诱导小鼠肝损伤,比色法测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)以及酒精肝损伤中三酰甘油(TG)的含量、肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)浓度,并作肝组织切片病理观察。结果GEP-2(25、50、100mg/kg)给药明显降低小鼠血清中升高的ALT和AST水平及酒精性肝损伤中TG含量,抑制肝脏中上升的MDA水平和提高过低的SOD活性。病理检查结果显示GEP-2有明显的保肝作用。结论GEP-2对小鼠CCl4肝损伤和酒精肝损伤均具有显著的保护作用。