天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白 (gastrodiaantifungalprotein简称GAFP)是从我国传统中药天麻 (GastrodiaelataBl.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质 ,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用 ,因此 ,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法 ,将GAFP的基因gafp转入 3个新疆彩色棉品种中 ,通过田间抗病筛选和分子检测 ,得到了高抗黄萎病的转基因植株 ,两株Southern杂交阳性植株LB_5_8和ZB_1_49对黄萎病表现整株免疫。RT_PCR的结果显示 ,LB_5_8和ZB_1_49中均有gafp的正确转录 ;离体的抑菌实验也表明 ,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制 ,表明了gafp在转基因植株中的正确表达 ,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁 ,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力 ,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。

天麻抗真菌蛋白基因(GAFP)转化彩色棉新品系抗黄、枯萎病性鉴定

将天麻抗真菌蛋白基因(GastrodiaAntifargalProtein,GAFP)利用花粉管通道法导入彩色棉品种新彩棉1号和新彩棉3号,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、农艺性状选择,培育出16个转基因新品系,对其在人工病圃进行田间黄、枯萎病的抗性鉴定,结果表明:参试的转基因品系中LB5007、ZB5020等5个品系既抗黄萎病又抗枯萎病,为兼抗类型;其余11个品系均为抗黄萎病耐枯萎病类型。

转天麻抗真菌蛋白基因彩色棉新品系抗枯黄萎病研究

将天麻抗真菌蛋白基因 (GastrodiaAntifargalProtein ,GAFP)用花粉管通道法转化天然彩色棉主栽品种和高代系 ,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、综合农艺性状选择 ,获得整合了GAFP的彩色棉花新品系。对其进行了室内抗枯萎病性鉴定和田间人工病圃抗黄萎病性鉴定。结果表明 :彩B5 - 8相对病指 4 93,为高抗枯萎病类型 ,彩B5 - 3相对病指 7 75、彩B5 - 9相对病指 8 0 9,为抗枯萎病类型 ;彩B5 - 7枯萎病、黄萎病相对病指分别为 9 95和 19 13,既抗枯萎病又抗黄萎病 ,是一个兼抗类型 ,彩B5 - 2相对病指 19 6 9为抗黄萎病类型。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

目前，我国棉花种植区一半左右面积都受黄萎病害影响，不仅显著降低棉花产量而且大大降低纤维质量。引发黄萎病的大丽轮枝菌，可在土壤中存活达10年以上，至今生产上没有任何有效杀菌剂，因此，培育抗病棉花品种被认为是防治黄萎病的重要手段，但因缺乏有效抗源，目前为止尚未成功培育高抗品种。因此，黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。

天麻抗真菌蛋白基因或可防治棉花黄萎病

黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。目前，中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性，其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括棉花”癌症”——黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性。其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

新疆陆地棉抗病转基因棉花的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆陆地棉 3个品种 (系 ) ,经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测 ,得到初步的筛选结果。

双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究

多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。

两种抗病基因双T-DNA区双元载体的构建

选择标记基因的删除是植物转基因工程中重要的步骤之一,双T-DNA区双元载体转化法以其共整合频率高、删除标记基因效率高的优点在植物遗传转化中应用非常广泛。本文通过构建天麻抗真菌蛋白基因、脂质转移蛋白基因双T-DNA区双元载体,为培育不含选择标记基因的抗病新材料奠定基础。通过PCR的方法克隆GAFP基因,产物纯化测序确定序列准确后与pSB130-35S载体进行BamHⅠ、SacⅠ双酶切;pCAMBIA2300-LTP、pSB130-35S经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后连接,连接产物转化大肠杆菌。采用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆,重组质粒pSB130-GAFP、pSB130-LTP双酶切产物大小分别为540bp、1200bp,与预期产物大小一致,pSB130-GAFP、pSB130-LTP双T-DNA区双元载体构建成功。载体pSB130-GAFP、pSB130-LTP转化根癌农杆菌后可以直接用于植物的遗传转化。

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定:首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg/L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1%的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62.5%的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料，研究6个影响杉木遗传转化效果的因素，初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为：预培养1—3d，OD600 nm为0．1-0．4的菌液浸染10-15min，共培养3—5d，共培养基附加乙酰丁香酮（AS）80μmol·L^-1，共培养后延迟3d筛选。在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素（Km）抗性芽，在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽。PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性，初步证明外源天麻抗真菌蛋白（GAFP）基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中。

生物防治

961062 无菌培养罗马柄锈菌的技术[英]/Bedi, J.S.…//Curr.Sci.-1995,69(1).-21～23[译自DBA,1995,14(17),95-10278] 由罗马柄锈菌引起的诱病可用作针对香附子的潜在生防因子。在不同温度(20、25、30和35℃)下研究了真菌的生长和孢子形成。

棉花抗黄萎病研究获得突破

中国科学院遗传与发育生物学研究所副研究员王义琴通过用蛋白提纯、测序和cdna文库筛选等方法从天麻中克隆到一个天麻抗真菌蛋白基因，命名为gafp，并证明gafp对包括黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性，进一步筛选天麻基因组文库发现，天麻中存在着4个gafp基因。