转天麻抗真菌蛋白基因提高棉花对黄萎病抗性

黄萎病是全球植棉业的主要病害,严重缺乏抗黄萎病资源导致棉花抗黄萎病育种至今未取得显著进展。采用农杆菌介导法,以下胚轴为受体,将天麻抗真菌蛋白基因转化陆地棉品系苏研060,通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和植株再生,获得大量再生苗。分别以NPT II基因、gafp基因、35S启动子-gafp基因特异引物对再生苗进行PCR检测,将95个阳性再生苗嫁接到海7124幼苗砧木上,获得37个成活植株。RT-PCR检测发现,31个植株出现预期的540 bp扩增片段。盆栽花铃期花粉育性鉴定表明,9个转基因植株雄性败育,22个植株花粉育性正常,通过人工自交得到T1代种子。通过转基因作物隔离区种植、特异引物PCR检测、卡那霉素抗性筛选、自交纯合与选择,培育获得22个T3代转基因纯系。Southern blotting检测发现,转基因植株体内有2个gafp基因拷贝。GAFP蛋白免疫印迹表明,16个转基因纯系出现分子量为14 k D的GAFP蛋白,另6个纯系表现出转录后水平上的基因沉默。黄萎病抗性鉴定结果证实,获得3个抗落叶型黄萎病的棉花株系TG09、TG16和TG23。

天麻抗真菌蛋白(GAFP)的N端序列测定及cDNA基因克隆

从新鲜天麻次生块茎中将天麻抗真菌蛋白(GAFP)提纯,然后测得其N端的30个氨基酸,根据氨基酸序列设计了一段30bp的核酸探针,从cDNA文库中筛选到了编码该蛋白的基因,为这一新型蛋白在抗真菌基因工程中的应用奠定了基础。

天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白 (gastrodiaantifungalprotein简称GAFP)是从我国传统中药天麻 (GastrodiaelataBl.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质 ,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用 ,因此 ,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法 ,将GAFP的基因gafp转入 3个新疆彩色棉品种中 ,通过田间抗病筛选和分子检测 ,得到了高抗黄萎病的转基因植株 ,两株Southern杂交阳性植株LB_5_8和ZB_1_49对黄萎病表现整株免疫。RT_PCR的结果显示 ,LB_5_8和ZB_1_49中均有gafp的正确转录 ;离体的抑菌实验也表明 ,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制 ,表明了gafp在转基因植株中的正确表达 ,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁 ,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力 ,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。

转天麻抗真菌蛋白GAFP基因烟草的获得及离体抑菌活性检测

通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导,采用叶盘法将天麻(GastrodiaelataBl.)抗真菌蛋白基因GAFP转入烟草(NicotianatabacumL.),PCR和Southern blotting分析证明已将GAFP基因整合进烟草植株。体外抑菌实验表明GAFP转基因的烟草植株对真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)表现出一定的抑菌活性。

天麻抗真菌蛋白基因转化彩色棉的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆彩色棉 3个品种 (系 ) ,经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测 。

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性(英文)

通过构建和筛选天麻 (GastrodiaelataBl.)基因组文库 ,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA。该基因组DNA含有一个 5 16碱基组成的编码区 ,没有内含子结构。其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒。为研究启动子活性 ,构建了 - 115 7bp启动子区与GUS基因的融合表达载体。并将其用农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草 (Nicotianatabacum)中 ,获得了稳定转化的烟草。利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析。结果表明 ,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达。GUS基因在根中的表达水平最高 ,茎中次之 ,叶中只有低水平表达。而且该启动子具有诱导表达活性 ,可被真菌及水杨酸、茉莉酸强烈诱导表达。

天麻抗真菌蛋白基因(GAFP)转化彩色棉新品系抗黄、枯萎病性鉴定

将天麻抗真菌蛋白基因(GastrodiaAntifargalProtein,GAFP)利用花粉管通道法导入彩色棉品种新彩棉1号和新彩棉3号,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、农艺性状选择,培育出16个转基因新品系,对其在人工病圃进行田间黄、枯萎病的抗性鉴定,结果表明:参试的转基因品系中LB5007、ZB5020等5个品系既抗黄萎病又抗枯萎病,为兼抗类型;其余11个品系均为抗黄萎病耐枯萎病类型。

转天麻抗真菌蛋白基因彩色棉新品系抗枯黄萎病研究

将天麻抗真菌蛋白基因 (GastrodiaAntifargalProtein ,GAFP)用花粉管通道法转化天然彩色棉主栽品种和高代系 ,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、综合农艺性状选择 ,获得整合了GAFP的彩色棉花新品系。对其进行了室内抗枯萎病性鉴定和田间人工病圃抗黄萎病性鉴定。结果表明 :彩B5 - 8相对病指 4 93,为高抗枯萎病类型 ,彩B5 - 3相对病指 7 75、彩B5 - 9相对病指 8 0 9,为抗枯萎病类型 ;彩B5 - 7枯萎病、黄萎病相对病指分别为 9 95和 19 13,既抗枯萎病又抗黄萎病 ,是一个兼抗类型 ,彩B5 - 2相对病指 19 6 9为抗黄萎病类型。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

目前，我国棉花种植区一半左右面积都受黄萎病害影响，不仅显著降低棉花产量而且大大降低纤维质量。引发黄萎病的大丽轮枝菌，可在土壤中存活达10年以上，至今生产上没有任何有效杀菌剂，因此，培育抗病棉花品种被认为是防治黄萎病的重要手段，但因缺乏有效抗源，目前为止尚未成功培育高抗品种。因此，黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。

天麻抗真菌蛋白基因或可防治棉花黄萎病

黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。目前，中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性，其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括棉花”癌症”——黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性。其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

新疆陆地棉转天麻毒蛋白基因GAFP特性研究

本研究利用花粉管通道技术将在天麻中克隆的天麻毒蛋白基因(GAFP)转化棉花,经PCR和RTPCR鉴定,证实得到了5个转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-3,672GAFP-4,672GAFP-5。通过两年在无病田和病圃中连续种植分析转基因植株抗病性、农艺性状和经济性状的研究,结果表明:外源基因GAFP的导入对棉花农艺性状和经济性状无显著影响;转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-5在病圃中的抗病指数、株高、产量和纤维品质与受体材料672差异显著(P<0.05),产量较对照提高近30%;转基因植株农艺性状和经济性状的各项指标均优于对照,具较强耐枯、黄萎病能力,且能稳定遗传。

双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究

多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。

新疆陆地棉抗病转基因棉花的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆陆地棉 3个品种 (系 ) ,经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测 ,得到初步的筛选结果。

新疆陆地棉转基因抗病品系材料的获得

天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein简称GAFP)是从我国传统中药天麻(Gastrodia elata Bl.)中分离得到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病的致病菌离体具有很强的抑制作用。研究将所获得的转GAFP基因的陆地棉经Southern点杂交,证实得到了2株高抗枯、黄萎病的转基因植株。其后代经过进一步的抗病性筛选、PCR鉴定、选育和扩繁,发现转基因陆地棉后代具有稳定的、较强抗枯、黄萎病能力。研究为新疆陆地棉通过植物抗病基因工程的方法进行抗病品种选育提供了一条新的途径。

天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定

目的:改良常用的植物DNA提取的CTAB,SDS法,以有效去除天麻多糖类杂质。方法:用CTAB法提取天麻鲜品不同部位(块茎、花序轴和胚芽)DNA;用生理盐水浸泡天麻干品之后,在应用CTAB,SDS法提取天麻干品的DNA;通过已知序列的天麻抗真菌蛋白基因片段的聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物测序鉴定天麻DNA及其质量。结果:提取了44份天麻样本DNA,用CTAB法提取天麻鲜品不同部位的DNA,成功地用于PCR扩增,并通过DNA测序进一步鉴定;应用改良的CTAB,SDS法提取天麻干品DNA可用于PCR扩增,但DNA测序未成功。结论:用CTAB法提取的天麻鲜品各个部位DNA均可用于基因分析,而用天麻胚芽提取DNA的效果最理想;改良CTAB法能有效提取天麻干品DNA,提取的DNA可用于基因扩增。

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性。天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长。笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础。

两种抗病基因双T-DNA区双元载体的构建

选择标记基因的删除是植物转基因工程中重要的步骤之一,双T-DNA区双元载体转化法以其共整合频率高、删除标记基因效率高的优点在植物遗传转化中应用非常广泛。本文通过构建天麻抗真菌蛋白基因、脂质转移蛋白基因双T-DNA区双元载体,为培育不含选择标记基因的抗病新材料奠定基础。通过PCR的方法克隆GAFP基因,产物纯化测序确定序列准确后与pSB130-35S载体进行BamHⅠ、SacⅠ双酶切;pCAMBIA2300-LTP、pSB130-35S经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后连接,连接产物转化大肠杆菌。采用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆,重组质粒pSB130-GAFP、pSB130-LTP双酶切产物大小分别为540bp、1200bp,与预期产物大小一致,pSB130-GAFP、pSB130-LTP双T-DNA区双元载体构建成功。载体pSB130-GAFP、pSB130-LTP转化根癌农杆菌后可以直接用于植物的遗传转化。

新疆彩色棉抗病转基因植株的病圃筛选

将用天麻抗真菌蛋白基因 (GAFP)转化的天然彩色棉 (棕色、绿色 )R0 代种子种植在黄、枯萎病混生的病圃中。根据标记基因的不同 ,分别用卡那霉素和除草剂 (Basta)对 9个筛选材料的R1代 1 92 5 3× 10 4株进行了筛选 ,入选 133株。入选的 133个植株经过四次抗病性鉴定、筛选 ,获得了抗病植株 16株。进一步进行分子检测 ,转化植株出现了杂交信号 ,证明了抗病基因的整合和表达。

天麻抗真菌蛋白研究进展

天麻抗真菌蛋白是从我国传统中草药天麻中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,对许多植物病原菌具有很强的抑制作用。该研究综述了天麻抗真菌蛋白的特性、作用机理、GAFP基因克隆、表达载体构建、转基因研究等内容,以期为天麻抗真菌蛋白的开发及综合利用提供参考。