天麻蛋白对OGD/R诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制研究

目的研究天麻蛋白对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制。方法将体外HT22细胞常规培养,生长至对数生长期后铺板并随机分为对照组、OGD/R组、依达拉奉组、天麻蛋白组。以连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol·L^(-1)合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,继而恢复为无血清高糖DMEM培养2 h进行复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型。依达拉奉和天麻蛋白为自氧糖剥夺前24 h开始即加入相应药物终浓度,持续至复糖复氧结束。采用MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法测定LDH泄露率,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,丙二醛(MDA)含量及活性氧(ROS)水平,流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western blot检测OGD/R诱导损伤的HT22细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、Nrf2、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平变化。结果与对照组相比,OGD/R组细胞存活率下降(P<0.01),LDH泄露率升高(P<0.01),SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01),MDA含量及ROS水平增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达量下降(P<0.01),Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.01);与OGD/R组相比,天麻蛋白可提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH泄露率(P<0.01),提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.01),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01),上调HT22细胞中Bcl-2、p-AMPK、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白的表达量(P<0.01),有效抑制Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)。结论天麻蛋白对HT22细胞OGD/R损伤具有神经保护作用,其机制与活性氧/线粒体凋亡通路、AMPKNrf2通路和缺氧诱导因子通路相关蛋白密切相关。

德江天麻蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用研究

为了探讨天麻蛋白对金黄色葡萄球菌(金葡菌)的抑制作用,本研究以德江天麻为原料,提取天麻蛋白,检测天麻蛋白在不同浓度和不同时间条件下对金葡菌抑菌率的影响.利用实时荧光定量PCR检测金葡菌的毒力基因的表达变化,用试剂盒检测天麻蛋白对金葡菌细胞外碱性磷酸酶含量的影响和总肠毒素表达量的影响,用细菌计数法检测天麻蛋白对感染金葡菌小鼠死亡保护率和肺部细菌数量的影响.结果显示,天麻蛋白分子量分布于25~35 kDa,其对金葡菌的抑菌率呈现出剂量依赖性,天麻蛋白的抑菌率随着与金葡菌作用时间的延长而增加;天麻蛋白可抑制金葡菌毒力基因sea,agrA,hla及总肠毒素的表达,又可增加金葡菌细胞外碱性磷酸酶含量,并且均具有浓度依赖性;天麻蛋白降低了金葡菌肺炎小鼠死亡率,减少了小鼠肺脏中金葡菌的定植数量.以上结果说明,天麻蛋白在宿主体内外均可抑制金葡菌的生长.

天麻蛋白制备抗铜绿假单胞菌多肽最佳胃蛋白酶水解条件

为研究天麻蛋白在胃蛋白酶水解条件下获得的多肽对铜绿假单胞菌抗菌活性。以牛津杯法测得的抑菌圈大小为指标,考察水解温度、水解时间、水解pH单因素对天麻蛋白水解产物抗菌活性的影响。在单因素基础上设计正交试验获得具最强抑菌活性的多肽水解工艺。结果表明:当水解温度37℃,水解时间3 h和水解pH为4时,天麻蛋白水解物具最强抗铜绿假单胞菌活性。抑菌圈达到17.25 mm。

天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白 (gastrodiaantifungalprotein简称GAFP)是从我国传统中药天麻 (GastrodiaelataBl.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质 ,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用 ,因此 ,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法 ,将GAFP的基因gafp转入 3个新疆彩色棉品种中 ,通过田间抗病筛选和分子检测 ,得到了高抗黄萎病的转基因植株 ,两株Southern杂交阳性植株LB_5_8和ZB_1_49对黄萎病表现整株免疫。RT_PCR的结果显示 ,LB_5_8和ZB_1_49中均有gafp的正确转录 ;离体的抑菌实验也表明 ,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制 ,表明了gafp在转基因植株中的正确表达 ,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁 ,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力 ,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。

天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究

为获取辣椒的抗真菌种质资源,运用RT-PCR技术扩增出GAFP的cDNA序列,通过基因工程技术构建植物表达载体pBI121-GAFP,并导入遵椒1号辣椒。转化后再生的植株经PCR检测,初步证实GAFP基因已经整合到辣椒基因组中,得到了GAFP基因转化遵椒1号辣椒植株。

转天麻抗真菌蛋白GAFP基因烟草的获得及离体抑菌活性检测

通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导,采用叶盘法将天麻(GastrodiaelataBl.)抗真菌蛋白基因GAFP转入烟草(NicotianatabacumL.),PCR和Southern blotting分析证明已将GAFP基因整合进烟草植株。体外抑菌实验表明GAFP转基因的烟草植株对真菌瑞氏木霉(Trichodermareesei)表现出一定的抑菌活性。

天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。

新疆陆地棉转天麻毒蛋白基因GAFP特性研究

本研究利用花粉管通道技术将在天麻中克隆的天麻毒蛋白基因(GAFP)转化棉花,经PCR和RTPCR鉴定,证实得到了5个转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-3,672GAFP-4,672GAFP-5。通过两年在无病田和病圃中连续种植分析转基因植株抗病性、农艺性状和经济性状的研究,结果表明:外源基因GAFP的导入对棉花农艺性状和经济性状无显著影响;转基因株系672GAFP-1,672GAFP-2,672GAFP-5在病圃中的抗病指数、株高、产量和纤维品质与受体材料672差异显著(P<0.05),产量较对照提高近30%;转基因植株农艺性状和经济性状的各项指标均优于对照,具较强耐枯、黄萎病能力,且能稳定遗传。

天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究

为获取辣椒的抗真菌种质资源，运用RT-PCR技术扩增出GAFP的cDNA序列，通过基因工程技术构建植物表达载体pB1121-GAFP，并导入遵椒1号辣椒。转化后再生的植株经PCR检测，初步证实GAFP基因已经整合到辣椒基因组中，得到了GAFP基因转化遵椒1号辣椒植株。

天麻抗真菌蛋白基因(GAFP)转化彩色棉新品系抗黄、枯萎病性鉴定

将天麻抗真菌蛋白基因(GastrodiaAntifargalProtein,GAFP)利用花粉管通道法导入彩色棉品种新彩棉1号和新彩棉3号,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、农艺性状选择,培育出16个转基因新品系,对其在人工病圃进行田间黄、枯萎病的抗性鉴定,结果表明:参试的转基因品系中LB5007、ZB5020等5个品系既抗黄萎病又抗枯萎病,为兼抗类型;其余11个品系均为抗黄萎病耐枯萎病类型。

转天麻抗真菌蛋白基因彩色棉新品系抗枯黄萎病研究

将天麻抗真菌蛋白基因 (GastrodiaAntifargalProtein ,GAFP)用花粉管通道法转化天然彩色棉主栽品种和高代系 ,转化后代经卡那霉素初筛、分子检测、综合农艺性状选择 ,获得整合了GAFP的彩色棉花新品系。对其进行了室内抗枯萎病性鉴定和田间人工病圃抗黄萎病性鉴定。结果表明 :彩B5 - 8相对病指 4 93,为高抗枯萎病类型 ,彩B5 - 3相对病指 7 75、彩B5 - 9相对病指 8 0 9,为抗枯萎病类型 ;彩B5 - 7枯萎病、黄萎病相对病指分别为 9 95和 19 13,既抗枯萎病又抗黄萎病 ,是一个兼抗类型 ,彩B5 - 2相对病指 19 6 9为抗黄萎病类型。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

目前，我国棉花种植区一半左右面积都受黄萎病害影响，不仅显著降低棉花产量而且大大降低纤维质量。引发黄萎病的大丽轮枝菌，可在土壤中存活达10年以上，至今生产上没有任何有效杀菌剂，因此，培育抗病棉花品种被认为是防治黄萎病的重要手段，但因缺乏有效抗源，目前为止尚未成功培育高抗品种。因此，黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。

天麻抗真菌蛋白基因或可防治棉花黄萎病

黄萎病一直被认为是棉花的“癌症”。目前，中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性，其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

天麻抗真菌蛋白基因或可攻克棉花“癌症”

中科院研究人员发现天麻中存在着4个抗真菌蛋白基因gafp，gafp对包括棉花”癌症”——黄萎病在内的多种真菌具有较好抗性。其中，gafp4具有最强的抑菌活性，且带有胞间质定位的信号肽可以明显增强抗性。

波密稀有品种绿杆天麻杂交后代品质的初步研究

目的:测定波密绿杆天麻与乌杆天麻杂交后代天麻素、天麻多糖、天麻蛋白的含量,为评定选择天麻的优质种源提供参考。方法:分别采用高效液相色谱法、分光光度计法、考马斯亮蓝法测定天麻素、天麻多糖、天麻蛋白含量,包括绿杆天麻(Gastrodia elata f.viridis)、乌杆天麻(G.elata f.glauca)、绿杆一代和乌杆一代。结果:天麻素含量:绿杆天麻(0.287%)>绿杆一代(0.207%)>乌杆一代(0.142%)>乌杆天麻(0.134%);天麻总糖含量:乌杆一代(23.4%)>绿杆天麻(15.9%)>乌杆天麻(14.2%)>绿杆一代(12.0%);天麻蛋白含量:绿杆一代(18.64mg/g)>乌杆一代(14.73 mg/g)>乌杆天麻(13.63 mg/g)>绿杆天麻(11.66 mg/g)。杂交子代天麻的天麻素、天麻多糖、天麻蛋白含量均不同程度高于亲代(绿杆天麻和乌杆天麻)。结论:利用波密绿杆天麻与乌杆天麻进行杂交,产生的天麻后代品质较高,为优质的天麻种源。

乌天麻Gastrodianin基因的鉴定及其在天麻发育进程中的表达

基于相似性克隆策略和RT-PCR,从兰科植物乌天麻(Gastrodia elataf.glauca)球茎克隆得到两个新的天麻抗真菌蛋白基因,命名为gastrodianin-4A(ga4A)和gastrodianin-4B(ga4B),并首次用Northern杂交研究了该基因在植物不同部位的转录表达。结果表明,天麻个体的不同部位只转录表达同一种Gastrodianin基因,纯化自球茎的Gastrodianin蛋白质的肽质量指纹谱与推导的Ga4A和Ga4B成熟蛋白的氨基酸序列相吻合;Northern杂交证明天麻的地上器官Gastrodianin基因转录表达量远远高于地下球茎,而次生球茎皮层组织的表达量比中柱和整个营繁茎的都高一些。天麻球茎Gastrodianin的外周表达模式可能是天麻在地下抵御蜜环菌(Armillaria mellea Karst)入侵球茎皮层内部的防卫机制之一,但该基因在天麻地上部分的高丰度表达暗示Gastrodianin可能蕴藏其它生理功能。

天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定

目的:改良常用的植物DNA提取的CTAB,SDS法,以有效去除天麻多糖类杂质。方法:用CTAB法提取天麻鲜品不同部位(块茎、花序轴和胚芽)DNA;用生理盐水浸泡天麻干品之后,在应用CTAB,SDS法提取天麻干品的DNA;通过已知序列的天麻抗真菌蛋白基因片段的聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物测序鉴定天麻DNA及其质量。结果:提取了44份天麻样本DNA,用CTAB法提取天麻鲜品不同部位的DNA,成功地用于PCR扩增,并通过DNA测序进一步鉴定;应用改良的CTAB,SDS法提取天麻干品DNA可用于PCR扩增,但DNA测序未成功。结论:用CTAB法提取的天麻鲜品各个部位DNA均可用于基因分析,而用天麻胚芽提取DNA的效果最理想;改良CTAB法能有效提取天麻干品DNA,提取的DNA可用于基因扩增。

海拔对乌红杂交天麻产量与品质的影响及其酶学作用机制

蜜环菌生物种和天麻的共生关系是二者侵染-消化系统相互作用的结果,受到温度等环境因子的调节。为揭示海拔对天麻产量及品质的影响,以及温度升高影响蜜环菌生物种-天麻共生关系的作用机制。该研究通过测定不同海拔栽培天麻的产量、主要药用成分天麻素和对羟基苯甲醇的含量;在室内对天麻共生体进行升温处理,测定天麻组织液几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶与多酚氧化酶的活性变化,及天麻组织提取液对蜜环菌菌丝体的抑制效应。结果显示:(1)海拔对乌红杂交天麻的产量和有效药用成分存在显著影响,在1600 m产量最高,且杂交天麻在海拔1600 m有效成分含量最高。(2)温度显著影响天麻组织的抑菌系统,且天麻的消化酶及防御酶系统对其的响应具有差异性,具体表现为低温状况下天麻的消化酶系统活性增强,高温时防御酶系统活性提升。(3)温度升高导致天麻组织液对蜜环菌菌丝体的抑制效果显著下降,天麻活体中可能存在促进蜜环菌生长的热失活因子。研究表明,天麻种植区海拔下降引起的温度升高可能削弱天麻消化和抑制蜜环菌的能力,从而破坏天麻-蜜环菌的共生平衡。该研究对于揭示蜜环菌-天麻的共生机制具有重要科学价值,并对天麻栽培的区划具有实际指导意义。

新疆陆地棉转基因抗病品系材料的获得

天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein简称GAFP)是从我国传统中药天麻(Gastrodia elata Bl.)中分离得到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病的致病菌离体具有很强的抑制作用。研究将所获得的转GAFP基因的陆地棉经Southern点杂交,证实得到了2株高抗枯、黄萎病的转基因植株。其后代经过进一步的抗病性筛选、PCR鉴定、选育和扩繁,发现转基因陆地棉后代具有稳定的、较强抗枯、黄萎病能力。研究为新疆陆地棉通过植物抗病基因工程的方法进行抗病品种选育提供了一条新的途径。

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定:首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg/L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1%的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62.5%的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。