β-1,3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建

将大豆的 β - 1,3葡聚糖酶基因与玉米的核糖体失活蛋白基因通过一个 6个氨基酸的柔性短肽链连接起来 ,形成 1个融合蛋白。其中编码区基因长 1830bp ,共编码 60 9个氨基酸和 1个终止密码子。经过使用蛋白质分析软件Antheprot4 .3和Prosis(v5.0 0 )对融合蛋白的二级结构、理化特性、潜在信号肽断裂位点等方面进行分析表明 :融合蛋白较好的保持了原来的两个蛋白的各项理化特性 ,维持了两种蛋白的二级结构。将此基因克隆到质粒PBI12 1上 ,构建成植物表达载体PBI/GR。

茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2的克隆与表达

克隆茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2,能够参与茶树的防卫反应,加深对Cs RIPs基因转录调控以及RIPs的生物学功能理解。以凫早2号的幼苗为实验材料,对茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因Cs RIPI和Cs RIP2进行了研究,其在营养钵生长了2 a,分析了Cs RIP基因克隆与序列、Cs RIP因编码产物的系统进化树、Cs RIP基因在不同组织中的表达等,并对Cs RIP基因编码产物的结构域分析和同源性进行了比较。

黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端的克隆与分析

为了克隆黑木耳核糖体失活蛋白cDNA 3′-端,根据随机测得的中间一段蛋白质序列设计简并引物,应用RT-PCR和3′-RACE反应方法,将得到的基因片段与质粒连接,并转化至大肠杆菌中,进行蓝白筛选,再通过琼脂糖凝胶电泳法和PCR法验证白斑,从而得到阳性重组质粒,最后克隆出该目的蛋白基因片段。结果表明,克隆出的cDNA 3′-端为330bp的开放阅读框(ORF),编码107个氨基酸和2个终止密码子。经试验证明和文献检索,克隆得到的cDNA 3′-端为一种新基因。

5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中CNRIP1基因甲基化及蛋白表达的影响

目的探讨5′-氮杂-2′-脱氧胞苷对人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中大麻素受体相互作用蛋白-1(CNRIP1)基因甲基化和蛋白表达的影响。方法取对数生长期NCI-H226和NCI-H520细胞株分为实验组和对照组,对照组细胞使用不含5′-氮杂-2′-脱氧胞苷的培养基继续培养;将实验组细胞分为0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组,分别使用含不同浓度(0.5、1.0、1.5μmol·L^-1)5′-氮杂-2′-脱氧胞苷的培养基继续培养。取各组培养72 h后的细胞进行DNA提取及蛋白提取,采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测各组细胞中CNRIP1基因的甲基化状态,采用Western blot检测各组细胞中CNRIP1蛋白表达。结果对照组和0.5μmol·L^-1组NCI-H226、NCI-H520细胞株均显示为甲基化,1.0、1.5μmol·L^-1组中2种细胞株均显示为非甲基化。0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组2种细胞株中CNRIP1蛋白表达量均高于对照组(P<0.05);0.5、1.0、1.5μmol·L^-1组2种细胞株中CNRIP1蛋白表达量随浓度的增加而升高,两两比较差异均有统计学意(P<0.05)。结论人肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H226和NCI-H520中CNRIP1基因发生甲基化可能是导致基因表达下调甚至失活的主要原因,5′-氮杂-2′-脱氧胞苷可以逆转CNRIP1基因甲基化状态,促进CNRIPI蛋白表达。

不同剂量活血、破血药对动脉粥样硬化小鼠主动脉Bcl-2及Bax基因表达的影响

目的观察不同剂量活血药(川芎、当归)、破血药(三棱、莪术)对动脉粥样硬化(AS)小鼠主动脉B细胞白血病-淋巴瘤-2(Bcl-2)及B细胞白血病-淋巴瘤-2相关蛋白基因(Bax)表达的影响。方法 64只4周龄Apo E基因敲除小鼠制备AS模型,模型制备成功后随机分为6组:模型对照组(模型组)、阿托伐他汀钙组(他汀组)、低剂量活血药组(低活血组)、低剂量破血药组(低破血组)、高剂量活血药组(高活血组)、高剂量破血药组(高破血组)。连续灌胃给药8周后,处理动物。选用RT-PCR检测主动脉组织Bcl-2及Bax基因m RNA表达并分析比较其结果。结果活血药、破血药均能显著上调Bcl-2、下调Bax基因表达水平(P<0.01)。其中在上调Bcl-2基因表达水平方面,破血药作用优于活血药(P<0.05或P<0.01),且高、低剂量组组间存在显著量效关系(P<0.01);在下调Bax基因表达水平方面,活血药作用显著优于破血药(P<0.01),且高、低剂量组组间存在量效关系(P<0.05或P<0.01)。结论活血药、破血药可通过调节主动脉Bcl-2及Bax基因表达水平,从而起到抗动脉粥样硬化的作用。

SFRP2与Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成机制中的研究

目的利用pull-down技术验证凋亡相关蛋白基因SFRP2(Secreted frizzled-related protein2)和骨母细胞特异性因子-2Periostin(Osteoblast-specific factor2)间的相互作用。方法构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的Periostin融合蛋白(HA-Periostin)的重组载体pCMV-HA-Periostin,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的融合蛋白(Myc-SFRP2)的重组真核表达载体pCMV-HA-SFRP2,单独或共转染人293细胞,利用pull-down技术验证Periostin与SFRP2间的相互作用。结果成功构建重组载体pCMV-HA-Periostin,与抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-SFRP2相互作用蛋白复合物后,可以检测到HA-Periostin的表达。通过体外蛋白质结合实验证实了Periostin与SFRP2间的相互作用。结论成功构建带HA标签的Periostin融合蛋白(HA-Periostin)的重组载体,利用pull-down技术证实了Periostin与SFRP2间的存在相互作用。

一个Rett综合征家系MECP2基因突变分析及X染色体失活研究

目的:研究R ett综合征(RTT)患者的M ECP 2基因突变,探讨X染色体失活在RTT致病机制中的作用。寻找临床基因诊断R ett综合征的实验方法。方法:首先采集R ett综合征先证者及家系成员的外周血提取基因组DNA,聚合酶链式反应扩增RTT致病基因M ECP 2的3个外显子和3′UTR(3′端非翻译区),琼脂糖凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的片段,PCR产物经纯化后直接测序。应用甲基化PCR(m ethy lation spec ific PCR,M SP)进行X染色体失活分析。结果:发现患儿M ECP 2基因的Exon3发生1个点突变C 473T(T 158M),该突变为新生突变。患儿与患儿母亲表现为非随机X染色体失活。结论:X染色体非随机失活在RTT的致病机制中发挥某种作用,C 473T(T 158M)点突变可作为典型R ett患者基因诊断的位点之一。

补肾活血方对慢性肾衰竭大鼠氧化应激、PI3K/Akt、Bcl-2/Bax的影响

【目的】探讨补肾活血方对慢性肾衰竭大鼠的治疗作用及机制。【方法】将40只SD大鼠分为正常组(10只)、模型组(9只)、补肾活血方低剂量组(10只)和补肾活血方高剂量组(10只)。除正常组外,其他组别大鼠采用腺嘌呤灌胃法复制慢性肾衰竭模型。造模成功后,补肾活血方低、高剂量组大鼠分别给予0.52、2.08 g/kg补肾活血方药液灌胃,每日1次,连续给药28 d。给药结束后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清肾功能指标尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)和尿酸(UA)水平及肾组织氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,苏木素-伊红(HE)染色法观察肾组织病理学变化,Western Blot法检测肾组织磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况。【结果】(1)与正常组比较,模型组BUN、SCr、UA水平均上升(P<0.05);与模型组比较,补肾活血方低、高剂量组BUN、SCr、UA水平均显著下降(P<0.05)。(2)与正常组比较,模型组MAD水平上升,SOD水平下降(P<0.05);与模型组比较,补肾活血方低、高剂量组MAD水平下降,SOD水平上升(P<0.05);(3)与正常组比较,模型组肾组织中出现轻度坏死和炎性细胞浸润,肾小管扩张,肾小球变形等病理学变化;与模型组比较,补肾活血方低、高剂量组肾组织病理情况均有改善。(4)与正常组比较,模型组大鼠肾组织PI3K、Akt蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,补肾活血方低、高剂量组大鼠肾组织PI3K、Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。(5)与正常组比较,模型组大鼠肾组织Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平上升(P<0.05);与模型组比较,补肾活血方低、高剂量组大鼠肾组织Bcl-2蛋白表达水平上升,Bax蛋白表达水平下降(P<0.05)。【结论】补肾活血方能够改善慢性肾衰竭大鼠肾脏损伤,其机制与减轻氧化应激、抑制PI3K/Akt信号通路、调控凋亡蛋白Bcl-2/Bax表达有关。

^125 I粒子诱导胃癌移植瘤B细胞淋巴瘤／白血病-2／腺病毒E1B19000相互作用蛋白3和Wnt9a基因表达和甲基化效应机制

本研究旨在探讨^125 I粒子诱导胃癌移植瘤B细胞淋巴瘤／白血病-2／腺病毒E1B19000相互作用蛋白3（BNIP3）和Wnt9a基因表达和甲基化效应机制，现报道如下。

P^(15)基因mRNA及其蛋白在原发上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的 探讨原发上皮性卵巢癌中P15基因mRNA(P15mRNA)及其蛋白的表达情况 ,以确定该基因在原发上皮性卵巢癌发生发展过程中的作用。方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)及免疫组化方法 ,对4 8例原发上皮性卵巢癌以及 15例正常卵巢组织P15mRNA及其蛋白进行了检测。结果 4 8例原发上皮性卵巢癌中P15mRNA表达缺失者 11例 (2 2 92 % ) ,P15蛋白缺失者 13例 (2 7 0 8% ,包括 11例P15mRNA表达缺失者 )。15例正常卵巢组织P15mRNA及其蛋白均有表达。P15mRNA及其蛋白表达缺失与原发性上皮性卵巢癌的组织学类型有关 (P <0 0 5 ) ,而与其FIGO分期及组织学分级无关 ,但随肿瘤临床期别和病理级别增高缺失率有增高的趋势。一致性检验显示P15mRNA与其蛋白表达关系密切 (P <0 0 5 )。结论 P15基因在原发上皮性卵巢癌中存在mRNA以及蛋白表达的异常 ,提示该基因的失活与原发上皮性卵巢癌的发生有关。

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG（high mobility group）蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白,它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用.应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术,分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子（ε-promoter,-177～+1bp）DNA的结合模式.实验结果表明,HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合,而HMG14/17不能与它结合.将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后,HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子DNA结合,而HMG14/17却能与之结合.结果提示,当ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时,它所结合的HMG蛋白是不同的,推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体ε-珠蛋由基因的表达调控.

B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3在肿瘤细胞凋亡与自噬中作用的研究进展

B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3（BNIP3）是一种能和腺病毒E1B 19000蛋白相互作用的线粒体促凋亡蛋白.随着对BNIP3基因靶向治疗研究的深入,近年还发现其诱导细胞自噬的作用.BNIP3相关的凋亡与自噬可能导致肿瘤细胞截然不同的结果.现对两者的机制及相互关系做一综述.

DAB2IP过表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及对E-cad-herin、Snail、Twist表达的影响

目的:研究失活蛋白-2相互作用蛋白基因(DAB2IP)过表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及对上皮间质转化(EMT)相关上皮细胞-钙黏蛋白基因(E-cadherin)、Snail、Twist蛋白表达的影响。方法:采用慢病毒介导DAB2IP过表达转染并筛选稳定人胃癌细胞SGC7901细胞株(过表达组),另设慢病组对照液转染的人胃癌细胞SGC7901作为慢病毒对照组,无转染人胃癌细胞SGC7901为空白对照组,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测各组人胃癌细胞SGC7901 DAB2IP基因表达水平,采用噻唑蓝法(MTT)及平板克隆形成试验检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901增殖的影响采用细胞划痕试验检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901迁移的影响,采用免疫印迹(Western Blot,WB)法检测过表达DAB2IP对人胃癌细胞SGC7901中EMT相关蛋白表达水平。结果:同一时间及不同时间,空白对照组和慢病毒对照组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和慢病毒对照组比较,24,48,72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。与24 h比较,48和72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增值抑制率显著升高(P<0.05),与48 h比较,72 h过表达组人胃癌细胞SGC7901中DAB2IP mRNA表达水平、细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。提示48 h过表达效果最佳,可用于下游试验。空白对照组和慢病毒对照组平板克隆形成率、细胞迁移距离、E-cadherin、Snail、Twist蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和慢病毒对照组比较,过表达组人胃癌细胞SGC7901平板克隆形成率、细胞迁移距离、Snail、Twist蛋白水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白水平显著增加(P<0.05)。结论:DAB2IP过表达可抑制人胃癌细胞SGC7901增殖、迁移,可能与上调E-cadherin蛋白表达,下调Snail、Twist蛋白表达有关。

SH-SY5Y细胞中过表达RIPK3对ZFP36基因转录的影响

目的探讨SH-SY5Y细胞中受体相互作用蛋白激酶-3(RIPK3)下游信号通路及其中的关键信号分子的作用。方法通过质粒转染的方式在实验组SH-SY5Y细胞内表达外源性RIPK3蛋白,将转染空载质粒载体SH-SY5Y细胞作为对照组。通过观察质粒所携带的绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达情况以验证转染结果,Westernblot对外源性RIPK3表达进行验证。MTT法检测细胞增殖活性,观察过表达RIPK3对细胞活性的影响,以确认其在细胞内是否具有生物活性。运用转录组测序技术(RNAseq)分别检测2组细胞内基因转录丰度并应用IngenuityPathway Analysis(IPA)数据库进行分析,获得RIPK3下游信号通路及关键分子。通过微滴式数字化PCR(dd PCR)对部分RNAseq结果进行验证。结果外源性RIPK3在细胞内具有生物活性,能够抑制SH-SY5Y细胞的增殖。RNAseq数据经IPA分析后得出锌指蛋白36(ZFP36)为RIPK3下游效应分子,其相关效应分子包括血管内皮生长因子(VEGF)、人脱帽酶2(DCP2)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肿瘤坏死因子(TNF)的转录丰度也发生了相应的变化。结论 RIPK3能够参与对ZFP36以及与其相关效应分子的转录调控,进而在神经系统的发育、炎症和肿瘤发生等生理、病理过程中发挥重要作用。

新基因功能研究的策略与方法

开展新基因功能研究在当前生物医学研究中变得日益重要.基因功能的研究策略主要包括新基因的生物信息学及体内表达规律分析、功能获得与功能失活策略研究、基因编码产物相互作用蛋白的研究.同时,结合近年来国内外的一些新进展,对与各种策略相关的一些技术方法也进行了介绍.

抑制EZH2表达对宫颈癌细胞凋亡的影响及机制

目的观察抑制人类Zest同源增强子(EZH2)表达对宫颈癌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法选择人宫颈癌细胞系Siha和C33A细胞,采用MTT法确定EZH2抑制剂3-去氮腺嘌呤(DZNep)在两种细胞中的半数抑制浓度(IC_(50))。将两种细胞分为DMSO组、1/2 IC_(50)组和IC_(50)组,分别以DZNep终浓度0、3、6μmol/L处理Siha细胞各组,以0、2、4μmol/L处理C33A细胞各组。培养48 h后收集各组细胞,采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况,采用Western blotting法检测EZH2蛋白、抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-X基因长片段(Bcl-xL)、促凋亡蛋白Bcl-2家族细胞凋亡相互作用因子(Bim)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达。结果在Siha、C33A细胞中,1/2 IC_(50)组、IC_(50)组早期凋亡率均高于DMSO组,IC_(50)组早期凋亡率均高于1/2 IC_(50)组(P均<0. 05)。IC_(50)组EZH2蛋白表达均低于1/2 IC_(50)组、DMSO组(P均<0. 05); IC_(50)组Bcl-xL蛋白表达均低于1/2 IC_(50)组、DMSO组,Bim和Caspase-3蛋白表达均高于1/2 IC_(50)组、DMSO组(P均<0. 05)。结论利用DZNep抑制宫颈癌细胞EZH2的表达后,能够诱导宫颈癌细胞早期凋亡,其机制可能与下调Bcl-xL蛋白表达并上调Bim和Caspase-3蛋白表达有关。

白细胞介素-1α、6对胰腺癌细胞分泌血管内皮生长因子A、C的调节作用

目的 探讨细胞活素白细胞介素 1α、6(IL 1α、IL 6)对胰腺癌细胞产生和分泌血管内皮生长因子(VEGF)A、C的调节。方法 用Northern杂交和Western杂交法分别分析人胰腺癌细胞株(ASPC 1、CAPAN 1、MIA PaCa 2、PANC 1、COLO 3 5 7和T3M 4)中VEGF A、C基因和蛋白的表达;以细胞活素IL 1α(10 μg/L)或IL 6(10 0 μg/L)刺激细胞株(CAPAN 1和COLO 3 5 7)后用逆转录 聚合酶链式反应技术(RT PCR)分析其VEGF A、C基因的表达。结果 Northern杂交法显示6种胰腺癌细胞株均有4.1kbVEGF A基因和2 .4kbVEGF C基因的表达;Western杂交法显示这6种胰腺癌细胞株均有分子量为43kDa的VEGF A蛋白质和分子量为5 5kDa的VEGF C蛋白质的表达。RT PCR分析法显示IL 1α使细胞株COLO 3 5 7产生VEGF A、C基因分别增加1～2倍、1倍,但对细胞株CAPAN 1无明显刺激作用;而IL 6刺激细胞株CAPAN 1产生VEGF A、C基因分别增加2～5倍、1倍,但对细胞株COLO 3 5 7无明显刺激作用。结论 胰腺癌中血管内皮生长因子A、C和细胞活素IL 1α、IL 6间的相互作用导致了癌细胞的血行和淋巴转移。

刘静

本研究应用农杆菌介导的方法,采用L9（34）正交试验设计,对影响宁阳大枣基因转化的各项因子进行了分析比较,并着重探索了Ca2＋浓度对侵染转化的影响.结果表明：侵染效率最高的组合为1/2 侵染液浓度,20 min 侵染时间和0 mg/L Ca2＋浓度.Ca2＋浓度在提高宁阳大枣基因转化效率方面没有明显促进效果.Ca2＋浓度仅对平均分化芽数影响较大,浓度为0 mg/L 时,平均分化芽数最多.本试验共获得27 株转化苗,试验转化效率为33.33%.

益气养阴化浊通络方对高糖诱导小鼠肾足细胞自噬ATG5、Beclin-1及BNIP3表达的影响

目的:观察益气养阴化浊通络方对高糖诱导的小鼠肾足细胞自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)、B细胞淋巴瘤-2蛋白相互作用中心卷曲螺旋蛋白1(B-cell lymphoma-2-interacting myosin-like coiled-coil protein 1,Beclin-1)及B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(B-cell lymphoma-2/adenovirus E1 B interacting protein 3,BNIP3)表达的影响,探讨其对自噬的作用。方法:选取Wistar大鼠,分别灌胃20,40,80 g·kg^(-1)益气养阴化浊通络方及生理盐水,制备低、中、高浓度含药血清和空白血清。体外培养小鼠肾足细胞,分为正常对照组、高糖组、益气养阴化浊通络方低、中、高剂量组和雷帕霉素组。CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕检测细胞迁移能力,qRT-PCR和Western blot检测微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 B,LC3B)、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达。结果:与空白对照组相比,高糖组足细胞增殖减弱,迁移能力增强,LC3B、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达显著减弱;与HG组相比,益气养阴化浊通络方低、中、高剂量含药血清组及雷帕霉素组均可促进足细胞增殖,抑制足细胞迁移,明显促进LC3B、ATG5、Beclin-1及BNIP3 mRNA和蛋白表达。结论:益气养阴化浊通络方能够促进高糖诱导的小鼠肾足细胞自噬,调节足细胞增殖及迁移。