荧光高效液相色谱法测定三种失眠模型大鼠脑组织氨基酸类神经递质的含量

目的测定睡眠剥夺大鼠脑组织氨基酸类神经递质的含量。方法复制药物诱导失眠动物模型、平台水环境诱导失眠动物模型、刺激诱导失眠动物模型,以Agilent 1100荧光检测器高效液相系统为检测工具,Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5μm)为色谱柱,柱温25℃,激发波长λex=357 nm,发射波长λem=455 nm,甲醇-50 mmoL/L醋酸钠缓冲液(pH=6.5)为流动相,采取梯度洗脱,测定正常组及模型组大鼠脑组织中谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(γ-GABA)、牛磺酸(Tau)的含量。结果谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸分别在10.06～0.0503、10.13～0.0506、10.05～0.0502、10.03～0.0501μg/mL范围内,其浓度与峰面积呈良好的线性关系(r分别为0.99995、0.99995、0.99985、0.99990)。测得药物诱导失眠大鼠脑组织中Glu、Gly、Tau、γ-GABA的含量为(0.2042±0.0145)、(0.0086±0.0005)、(0.0919±0.0024)、(0.0421±0.0011)μg;平台水环境诱导失眠大鼠脑组织中Glu、Gly、Tau、γ-GABA的含量为(0.2144±0.0159)、(0.0085±0.0004)、(0.0966±0.0035)、(0.0433±0.0012)μg;刺激诱导失眠大鼠脑组织中Glu、Gly、Tau、γ-GABA的含量为(0.1818±0.0043)、(0.0084±0.0005)、(0.0824±0.0033)、(0.0414±0.0018)μg;正常大鼠脑组织中Glu、Gly、Tau、γ-GABA的含量为(0.1744±0.0038)、(0.0085±0.0004)、(0.0791±0.0022)、(0.0406±0.0012)μg。结论本实验建立的方法能满足同时测定大鼠脑组织中谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸的含量测定的需要,Glu、Tau、γ-GABA与失眠可能存在一定的量效关系,三种失眠动物模型均能较好的反映出脑内氨基酸类神经递质的变化。

探讨半夏-薏苡仁对PCPA失眠模型大鼠海马食欲素及其受体和血清细胞因子的调控作用

背景失眠症的发病率逐年增加,对人类身心健康造成严重危害。半夏-薏苡仁(BX-YYR)主要有效成分包括黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇等,但其治疗失眠症的具体作用机制尚不明确。目的 研究BX-YYR干预对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DLphenylalanine,PCPA)失眠模型大鼠的食欲素(Orexin)及其受体、细胞相关因子的调控作用。方法 采用PCPA诱导失眠大鼠模型,将实验大鼠分为6组,每组15只,分别为正常组(N)、模型组(M)、地西泮组(D)和BX-YYR低(ZL)、中(ZM)、高(ZH)剂量组,各组按10 mL/kg进行对应灌胃处理,连续7 d。进行戊巴比妥钠翻正实验和旷场实验。HE染色观察海马结构,免疫组化观察海马B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、IL-2、IL-6和Orexin含量,RT-PCR法检测OX1R和OX2R mRNA表达;Western blot法检测OX1R和OX2R表达。结果 戊巴比妥钠翻正实验显示失眠模型大鼠睡眠潜伏期显著延长、睡眠持续时间显著缩短(P均<0.01);旷场实验中模型大鼠总活动距离减少、进入中央格距离和修饰次数增加(P均<0.01)。HE染色显示,M组海马CA1区神经元形态和结构损伤比较严重,BX-YYR各剂量组则相对减轻。免疫组化显示,与M组比较,ZH组大鼠海马Bcl-2阳性信号面积占比升高(P<0.01)。ELISA显示,与M组比较,D组和ZL、ZM、ZH组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6显著降低(P均<0.05),D组和ZM、ZH组大鼠血清和海马Orexin水平显著降低(P均<0.01)。RT-PCR显示,与M组比较,ZL、ZM、ZH组海马OX1R mRNA表达降低(P均<0.05)。Western blot检测显示,与M组比较,ZL、ZM、ZH组大鼠海马OX1R表达降低(P均<0.01),D组和ZL组大鼠海马OX2R表达升高(P均<0.05)。结论 BX-YYR能够改善PCPA失眠模型大鼠的睡眠情况,同时调控血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6水平,其作用机制可能与调节海马Orexin、OX1R、OX2R表达,上调Bcl-2表达,从而抑制海马神经元细胞凋亡有关。

持续光照建立斑马鱼失眠模型及评价

目的 利用斑马鱼建立睡眠剥夺模型,为失眠的基础研究提供更多可靠的实用建模参考方案。方法 选取4月龄同一批次野生型AB系雄性斑马鱼160尾作为实验对象,随机分为对照组(CK组)和睡眠剥夺1~7 d组(SD1~SD7组)。对照组置于正常14 h/10 h明/暗交替环境,睡眠剥夺组分别利用模拟日光对其进行不同时间的持续光照达到剥夺斑马鱼睡眠的效果。造模结束后,比较各组斑马鱼运动形式、学习记忆能力、生物钟基因表达、脑部超微结构的改变。结果 运动形式结果显示:与CK组斑马鱼相比,SD1、SD2、SD3组斑马鱼静息时间均增多(P<0.05),SD3组斑马鱼大运动时间及大运动计数较CK组减少(P<0.05);学习记忆能力结果显示:CK组斑马鱼学习记忆能力较SD1、SD2、SD3组强,(P<0.05、0.01),SD1组斑马鱼学习记忆能力较SD2、SD3组斑马鱼强(均P<0.01),SD2组斑马鱼学习记忆能力较SD3组斑马鱼强(P<0.01);qRT-PCR结果显示:与CK组相比,SD3组斑马鱼脑部周期蛋白1a(Per1a)、周期蛋白2(Per2)、脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(Bmal1)、隐色素1b(Cry1b)mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05);电镜结果显示:SD2及SD3组斑马鱼大脑神经元出现神经元坏死现象,镜下可见细胞核塌陷,边界破裂甚至溶解,核染色质固缩,线粒体出现肿胀,甚至大量空泡。结论 持续光照3d可改变斑马鱼运动形式,使其学习记忆能力下降,改变了与睡眠相关的时钟基因表达,诱发了脑部神经元凋亡,可以用来建立斑马鱼失眠模型。