毛细管电泳分析7-氨基头孢霉烷酸生产过程

建立了高效毛细管电泳分析法检测7-氨基头孢霉烷酸生产过程。采用未涂层石英毛细管柱,缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0),运行电压30kV,检测波长254nm。7-氨基头孢霉烷酸、头孢菌素C和戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸的线性范围(mg/ml)分别为0.05～3(r=0.998)、0.1～3.5(r=0.992)和0.1～5(r=0.996),迁移时间和峰面积的RSD分别为0.5%、1.0%、0.6%和2.2%、3.0%、2.4%。

培养条件对头孢霉菌丝体脂肪酸组分的影响

研究了头孢霉 (Cephalosporiumsp .)菌丝体最大生产力和多不饱和脂肪酸形成积累的条件。菌丝体最适培养条件为 :麦芽糖 60 g/L、KNO33g/L、起始 pH为 6 0、50 0mL三角瓶装 1 0 0mL培养基、接种 2 5%、2 5℃培养 1 0d则菌丝体达到最大干重。多不饱和脂肪酸形成积累的最适条件为 :葡萄糖 1 0～ 2 0 g/L、(NH4) 2 SO4或NH4Cl 3g/L、培养基起始 pH为 4 0、50 0mL三角瓶装 1 0 0mL培养基、接种 1 0 %～ 2 0 %、1 0℃下照光培养。因此 ,在整个生产流程中可采用不同条件分段掌握的技术原则。同时提出在多不饱和脂肪酸的形成和积累途径中油酸 (1 8∶1 )向亚油酸 (1 8∶2 )的转化是关键 ,为进一步探索最适培养条件和关键酶的调节提供依据。

石英砂研磨法快速提取顶头孢霉染色体DNA

本研究的目的是改进头孢菌素C产生菌顶头孢霉基因组DNA的提取方法。采用氯化苄法、液氮研磨法以及石英砂研磨法进行比较,从提取的DNA数量及纯度来分析,石英砂法要好于液氮研磨法,与氯化苄法效果相当,但避免了氯化苄的毒性。提取液的pH对结果影响不大,当pH为9.0～10.0之间时,收率稍高;EDTA浓度应大于40 mmol/L。经石英砂研磨破壁,获得了较高质量的染色体DNA,该法与液氮研磨法、氯化苄法相比廉价、快速、安全,且不影响其后续的分子生物学操作。

培养条件对头孢霉脂肪酸链长和ω-3脱饱和的影响

为了获得高产量的长链ω-3多不饱和脂肪酸，用十八碳脂肪酸和十六碳脂肪酸的比值考察碳链延长，用α-亚麻酸和亚油酸的比值考察ω-3脱饱和；探讨了八种因子对脂肪酸链长和ω-3脱饱和的影响。有利于碳链延长的条件为：麦芽糖10g/L、(NH4)2SO4 3g/L、起始pH为4.0、500mL三角瓶装50mL培养基、接种20%（V/V）、20℃培养6d。有利于ω-3脂肪酸生成的条件为：蔗糖30g/L、NH4Cl 3g/L、培养基起始pH为4.0、500mL三角瓶装50mL培养基、接种20%（V/V）、10℃培养10d。

头孢霉AL031真菌菌丝体化学成分研究(Ⅱ)

从具有抗细菌、真菌活性的头孢霉AL031真菌菌丝体中又分离出3个化合物,通过理化常数测定和波谱分析鉴定它们的结构分别为3-羟基-7,22-麦角甾二烯-6-酮、青霉酸、4-羟基-3,6-二甲基-2-吡喃酮,以上3种成分均为首次从该真菌的培养物中分得。

头孢霉AL031菌株液体培养工艺的研究

研究产生异香豆素类化合物的头孢霉 (Cephalosporium sp.) AL 0 31菌株的培养基和摇瓶培养条件 ,并通过正交试验进行优化。结果表明 ,其适宜的培养基组成 (% ) :马铃薯 (煮汁 ) 2 0 ,葡萄糖和蔗糖 (1∶ 2 ) 2 .0 ,KH2 PO40 .1,Mg SO4· 7H2 O0 .0 5 ;Vitam in B1 0 .0 1。摇瓶培养条件为 :培养基的起始 p H为 7,5 0 0 ml三角瓶装量 2 0 0 m l,接种量10 %。 2 4°C振荡培养 4d,细胞生物量为 10 .8m g/

烟草头孢霉F_2对氯化汞解毒作用的研究

烟草头孢霉F_2在含200mg/L HgCl_2的液体培养基中生长16h,汞量减少了90％,此后菌量迅速增加,试验了营养条件、HgCl_2浓度、前培养条件、pH及温度等对F_2菌汞解毒作用的影响,初步研究了解毒作用机理.结果表明,该菌能将HgCl_2还原成为元素汞,据分析,约12％的汞挥发到气相中,7％被菌体吸收,其余以元素汞颗粒的形态沉积在培养液底部.

头孢霉AL031真菌菌丝体化学成分研究(Ⅰ)

从具有抗细菌、真菌活性的头孢霉素属AL031真菌菌丝体中分离出5个化合物,通过理化常数测定和波谱分析鉴定它们的结构分别为麦角甾醇(Ergosterol,Ⅰ)、2,4,6-辛三烯酸(2,4,6-Octatrienoic acid,Ⅱ)、琥珀酸(Suc-cinic acid,Ⅲ)、尿嘧啶(Uracil,Ⅳ)、D-甘露醇(D-Mannitol,Ⅴ)。以上5种成分均系首次从该真菌的培养物中分得。

顶头孢霉pcbAB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用

用PCR方法从丝状真菌顶头孢霉中克隆出全长 1 3kb的pcbAB_pcbC双向启动子DNA片段 ,通过转化子对博莱霉素的抗性证明了该启动子在顶头孢霉中的双向启动功能。另外 ,利用所克隆的pcbAB_pcbC双向启动子构建了一个用于顶头孢霉转化的质粒pYG13,并成功地将该质粒转化入顶头孢霉。pYG13含有博莱霉素抗性基因和透明颤菌血红蛋白基因 (vgb) ,Southern杂交和CO结合实验分析显示vgb整合到顶头孢霉的基因组DNA中并表达了有活性的透明颤菌血红蛋白。

带TrpC启动子的质粒pYG715/Vgb对顶头孢霉的转化

分别以来自于构巢曲霉和酿酒酵母的启动子ＴｒｐＣ和ＴＥＦ１来构建质粒ｐＹＧ７１５／ＴｒｐＣ和ｐＺＲ３３３并转化头孢菌素Ｃ工业生产菌种顶头孢霉，结果发现只有ｐＹＧ７１５／ＴｒｐＣ产生转化子。

八种因素对头孢霉菌丝脂肪酸不饱和指数的影响

为了探讨环境胁迫和真菌脂肪酸不饱和度的关系 ,用合成培养基探讨 8种单一因子对头孢霉(Cephalosporiumsp .)菌丝体脂肪酸不饱和指数的影响。结果表明 ,低起始 pH值 (4 .0～ 5 .0 ) ,低培养温度 (10～ 15℃ ) ,有利于获得高不饱和指数 ;随着三角瓶装液量的增加 ,脂肪酸不饱和指数逐步降低 ;接种量对脂肪酸不饱和指数影响不大 ;葡萄糖或蔗糖作为碳源 ,NH4 Cl或 (NH4 ) 2 SO4 作为氮源 ,低碳源浓度 (10～ 2 0g/L)有利于获得高不饱和指数 ;随着培养时间增加 ,脂肪酸不饱和指数逐步增加 ,至 10d时脂肪酸不饱和指数可达最高 ,为 170 .

头孢霉AL031真菌次生代谢产物的抗菌活性研究

采用滤纸片法 ,以 11株革兰氏阳性或阴性细菌为指示菌 ,对从头孢霉AL0 31真菌次生代谢产物中分离到的 14个化合物进行了体外抗细菌活性筛选。结果表明 :新化合物 :S ( +) 5 羟基蜂蜜曲菌素、S ( +) 7 羟基蜂蜜曲菌素和已知化合物 :蜂蜜曲菌素、2 ,4 -二羟基 3,6 二甲基苯甲酸、3,6 二羟基 2 ,4 二甲基苯甲酸、琥珀酸具有广谱的抗细菌活性 ,采用杯碟法 ,以三种细菌为指示菌 ,测定了具有抗菌活性的 6个化合物的最低抑菌浓度 (MIC) ,其MIC为 0 0 312 5～ 0 5mg/ml。

菌种储藏温度及菌种活化对头孢霉脂肪酸组分的影响(英文)

为了获得高含量的二十二碳六烯酸(DHA),对不同储藏温度对头孢霉脂肪酸组分的影响进行研究。将菌种储藏在20℃,4℃和-20℃三种温度下,比较不同储藏时间及菌种活化对菌丝脂肪酸组分的影响。结果表明菌种储藏温度、时间及发酵前菌种是否活化都影响脂肪酸组分。发酵前活化菌种,DHA含量均在10d达到最大;不活化菌种,20℃储藏菌种,DHA在20d可以达到最大;4℃,在25d可以达到最大;-20℃,在5d可以达到最大。除4℃外,其它两种温度下多不饱和脂肪酸变化和DHA变化趋势均一致。20℃,脂肪酸不饱和指数和18∶3/18∶2的变化与DHA变化一致。-20℃储藏菌种,如发酵前不活化菌种,其DHA,脂肪酸不饱和指数和多不饱和脂肪酸变化幅度均为六组最小,可能在这种温度下,菌丝调节脂肪酸变化的能力受到损伤。本研究可以为发酵生产多不饱和脂肪酸提供理论参考。

头孢菌素C酰基转移酶在顶头孢霉中的表达

以假单胞菌的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶为基础,根据顶头孢霉密码子偏爱性及RNΑ二级结构预测分析,设计并合成了全长2349bp的CPC酰基转移酶基因ecs,并将其在大肠杆菌中表达。结果证明,表达蛋白能将CPC转化为7-ΑCΑ。将ecs表达质粒转化CPC产生菌顶头孢霉,通过PCR、Southern blotting以及Western blotting等方法验证,表明ecs基因已成功整合到顶头孢霉染色体上并得到表达,重组菌的发酵也显示部分CPC直接转化成了7-ΑCΑ。

固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸

部分纯化的变异三角酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)在碱性条件下变性过氧化氢酶,再与大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯高聚物共价交联。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度升高,最适pH范围变宽,对温度和pH的稳定性都有明显的提高。固定化DAO在搅拌反应器中催化头孢霉素C(CPC)转化为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸(Gl-7-ACA)。以0.03g/mL的CPC为底物,在温度25℃、pH7.2条件下,产物的得率>93%,副产物得率<5%。经过110批反应后,固定化酶保持64%的初始活力。

头孢霉(Cephalosporiumsp.)发酵生产α-亚麻酸

研究了 8种因子对头孢霉 (Cephalosporiumsp .)发酵产α 亚麻酸产量及其占总脂肪酸百分含量的影响。有利于获得α 亚麻酸高产的条件包括 :培养基中碳源为蔗糖 30g/L ,氮源为 (NH4 ) 2 SO4 3g/L ,起始pH为 6 0 ,5 0 0ml三角瓶装 10 0ml培养基 ,接种 2 0 % (v/v)的菌种 ,2 0℃培养 10d。在此条件下 ,α 亚麻酸产量达 87 6 6mg/L ,占总脂肪酸百分含量为 2 3 85 % ,干菌丝产量达到 7 82g/L ,油含量占菌丝干重的 8 0 8%。

头孢霉AL031真菌固体发酵产物抗氧化、抑菌活性研究

基于原有固体发酵条件,以提取物清除DPPH自由基的能力为评价指标,探讨头孢霉AL031真菌固体发酵的最佳时间和次生代谢产物的提取条件。用DPPH法和光敏化合物微生物法测定其次生代谢产物的抗氧化活性,微生物纸片法测定其抑菌活性。结果表明:头孢霉AL031真菌固体发酵的最佳培养时间为9d,最佳提取条件为以乙酸乙酯浸泡,其提取物对DPPH自由基的EC50为5.84μg/mL,光敏化合物微生物法亦证明其具有良好的抗氧化活性。抑菌实验表明头孢霉AL031真菌的次生代谢产物具有广谱抑菌作用。

顶头孢霉遗传育种研究进展

顶头孢霉是一类重要的工业微生物,其发酵产物头孢菌素C可用来生产7-ACA,而后者是临床常用抗感染药物头孢类抗生素的重要中间体。头孢菌素C的发酵水平决定了其下游头孢类抗生素的生产水平、产品质量及价格,因此对顶头孢霉的菌种选育工作显得尤其迫切。随着分子生物学的发展,基因工程分子改造在遗传育种领域发挥着越来越重要的作用。文章综述了对头孢菌素C的生物合成以及调控的研究进展,并将国内外对顶头孢霉进行遗传育种的结果进行了归纳总结,提出了可以从提高头孢菌素C发酵水平、延伸代谢途径等不同方面对头孢菌素C生物合成及调控基因,包括外源基因的导入和表达进行改造优化,并对进一步的研究目标进行了展望,认为可以结合比较蛋白质组和基因组改组使遗传育种所获得的工程菌尽快进入产业化。

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌-酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pGBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0.5-2.0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。

顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为：在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×10^7个/mL;在以KC（0.6 mol/L KCl＋25mmol/L CaCl2.2H2O）为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。