头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２７４２２ 是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌，实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素Ｃ 敏感的阻断变种Ｓ６ ，并以它为受体宿主， 以质粒ｐＩＪ６９９ 为载体， 建立野生型头状轮生链霉菌菌株ＡＴＣＣ２７４２２ 的基因库。采用鸟枪法克隆技术，从库中筛选获得含有丝裂霉素Ｃ 抗性基因的６２ｋｂ 外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒ｐＬＸ５ 导入变铅青链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ） 获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将ｐＬＸ５ 导入野生型菌株中，使其对丝裂霉素Ｃ 的抗性大幅度提高：最低抑制浓度（ ＭＩＣ） 由原来的２００μｇ／ｍ Ｌ 上升至１０００μｇ／ ｍＬ 以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ＡＴＣＣ２７４２２（ｐＬＸ５） 的丝裂霉素产量高于野生菌株ＡＴＣＣ２７４２２ ，因此丝裂霉素Ｃ

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn^(2+)或Mg^(2+),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn^(2+)对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca^(2+)等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。

头状轮生链霉菌芳香族氨基酸合成途径的调节

对头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)芳香氨基酸合成途径的研究表明,第一个酶即3—脱氧—α—阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶无同工酶,不被L-色氨酸阻遏,比活力可被硝酸盐促进。L-色氨酸强烈地反馈抑制此酶,L-酪氨酸和L-苯丙氨酸无作用。L-色氨酸的反馈抑制对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是非竞争性的,K_i为373μmol/L。酶对PEP和4-磷酸亦藓糖(E4P)的K_m值分别为50和100μmol/L。PEP和C0^(2+)对酶有稳定作用。邻氨基苯甲酸合成酶活力可被1mmol/L L-色氨酸完全抑制,此酶也受L-色氨酸的阻遏,但是色氨酸支路上其余4个酶不被阻遏。分支酸变位酶被L-酪氨酸抑制。L-苯丙氨酸抑制预苯酸脱水酶,并更强地抑制预苯酸脱氢酶。