小分子化合物开放夹心免疫分析研究进展

基于抗原-抗体识别的免疫分析技术在小分子监测领域占有重要地位,已成功应用于生理活性物质、化学有害物、农兽药等的快速检测,在临床诊断、环境、食品以及卫生领域发挥重要作用。由于缺乏结合位点,小分子化合物的分析大多采用竞争模式,与传统的三明治夹心法相比,稳定性和灵敏度往往都难以满足实际检测需求。近几年来,科学家开始尝试建立针对小分子化合物的非竞争模式免疫分析方法,比如基于抗独特型抗体、基于抗体可变区片段、基于抗异型抗体及抗免疫复合物多肽。其中基于抗体重链和轻链结合的开放夹心免疫分析由于具有只需要单个抗体、快速非竞争的均相检测小分子等优点,备受研究者关注。本文主要综述基于抗体可变区片段的小分子非竞争免疫分析方法,重点介绍了建立小分子非竞争检测模式所需要抗体可变区的获得及筛选途径、几种形式信号放大载体的研究现状,最后对其在小分子物质检测领域的应用前景进行了评述,期望能为本领域研究提供借鉴。

基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析

建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗AOZ单克隆抗体并以辣根过氧化物酶标记的亲和素或抗生物素抗体作为第二结合物可实现AOZ的夹心酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)。从实际应用的角度,得到双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下两个表位的极限距离,分别为12Å和13Å,理想距离分别为16Å和17Å。在双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下的检出限分别达到1.8 pg/mL和0.8 pg/mL(以AOZ质量浓度计),相对于竞争ELISA,其灵敏度最高提高了25倍。平均回收率为73%~85%,平均相对标准偏差为9.0%。

酶联免疫吸附分析双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起5周岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原体.目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的7项呼吸道病毒检测试剂盒,但其价格昂贵,且需荧光显微镜辅助诊断,不利于在基层医疗机构中推广,国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测.为此建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂,并以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测为参比,同时使用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床鼻咽抽吸物(NPA)样本进行检测.ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%和74.14%,特异度分别为100%和96.30%,Kappa值分别为0.787 1和0.689 5,两者均与RT-PCR检测结果具有高度一致性.此外,将ELISA双抗夹心法与免疫荧光法比较,两者无显著差异(p>0.05).综上,ELISA双抗夹心法操作简便,特异性高,有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断.

TSH双位点夹心免疫放射分析对甲亢的疗效观察

ＴＳＨ双位点夹心免疫放射分析对甲亢的疗效观察蔡金来，邱平，吴根秀，何炳烈，刘纬星（南昌核医学教研室３３０００６）用抗甲状腺药物（ＡＴＤ）治疗甲亢，需要较长时间地服药，而对疗效的评价，何时停药，停药后是否复发等问题在临床上较难掌握。据报道￣［１］，在临...

用多克隆抗体构建的夹心免疫传感器检测心肌肌钙蛋白I

用表面等离子体子共振生物传感器构建对心肌肌钙蛋白 I特异性的免疫传感器检测心肌肌钙蛋白 I,并建立两种检测方法 :直接法的最低检测限为 2 .5 μg/L,基于传感膜上的夹心免疫法的灵敏度为 0 .5 μg/L,检测范围为 0 .5～ 2 0 μg/L,批内及批间精密度分别为 3 .5 %～ 4.9% ,6.1 %～ 7.4% ;用夹心法及国外试剂盒对 40名健康献血者和 2 0例急性心肌梗死患者血清心肌肌钙蛋白 I水平进行检测 ,两者符合率为 95 % .

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测杏仁过敏原苦杏仁球蛋白

提取中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁球蛋白,分别制备兔和鼠多克隆抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法。结果表明:对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为(6.36±1.02)μg/L;对中国苦杏仁及美国大杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限分别为(12.11±1.70)μg/L和(18.95±1.52)μg/L,且与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛乳中杏仁过敏原的检测,苦杏仁球蛋白的添加回收率为78.94%～125.15%,且相对标准偏差均低于5.81%。

狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光分析试剂盒研制

目的研制狂犬病毒(RV)核蛋白(NP)时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)试剂盒。方法采用双抗体夹心法建立RV NP TRFIA试剂盒,对试剂盒的各项指标进行评价。结果试剂盒准确度好,线性范围为5～2 500mEU/mL,灵敏度为1.018mEU/mL,精密度良好,分析内精密度为2.7%～9.3%,分析间精密度为3.5%～12.2%。将15份疫苗样品用本法与国内常用ELISA检测试剂盒同时检测,其相关系数r为0.85,稳定性试验表明试剂可以在4℃稳定半年,37℃稳定7d。结论试剂盒各项已检测指标达到临床检验要求,有望进一步作临床检测试验。

电化学免疫传感器检测人附睾蛋白4的新方法

目的建立一种基于石墨烯和纳米金粒子自组装纳米复合物检测卵巢癌患者血清人附睾蛋白4(HE4)的电化学免疫检测新方法。方法将石墨烯和纳米金粒子复合物组装在丝网印刷电极(SPE)表面,利用纳米金粒子比表面积大和石墨烯电子传导速率快等特点,将大量的HE4一抗吸附在纳米金表面,继而结合大量抗原。根据双抗体夹心法原理,大量的辣根过氧化物酶标记的抗体也与抗原结合,利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢(H2O2)产生的电流信号测定HE4水平。结果新建传感器检测HE4的范围是0~400 pmol/L,检出限(LOD)是0.5 pmol/L。结论所建方法可用于早期评估受检者患卵巢癌的风险,是临床早期诊断卵巢癌快速、简便的新方法。

双抗体夹心ELISA法定量检测左旋多巴

目的建立左旋多巴的酶联免疫定量分析方法。方法以左旋多巴与载体蛋白钥孔戚血蓝素偶联,制备免疫抗原Levodopa-KLH。采用杂交瘤技术制备的特异性抗左旋多巴单克隆抗体作为包被抗体,待测左旋多巴为夹心抗原,免疫抗原Levodopa-KLH免疫新西兰兔得到的多克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定左旋多巴的双抗体夹心ELISA方法。结果左旋多巴浓度在40～2 000 ng/mL范围内呈良好线性关系,Y=0.8367 X+0.3423,相关系数r2=0.993 3,检测限为20 ng/mL。经方法学考核,批内、批间变异系数分别为9.53%和12.77%,平均回收率为87.86%,与卡比多巴、多巴胺、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、肾上腺素、维生素C、5-羟色胺、金刚烷胺基本无交叉反应,健全性分析表明,人血清稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好。结论这种定量检测左旋多巴的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为左旋多巴研究提供了定量检测的方法,并为药代动力学、临床血药浓度监测提供备选方法。

流动注射协同增强化学发光免疫分析法测定胰岛素

目的 建立一种测定胰岛素的非放射性免疫分析新方法。方法 将流动注射分析法、免疫分析法和化学发光分析法集为一体 ,以辣根过氧化物酶标记抗体 ,四苯硼钠与对苯苯酚协同增强的鲁米诺 过氧化氢发光混合液作为发光体系。根据固相夹心免疫分析原理 ,建立流动注射协同增强化学发光免疫分析法测定胰岛素。结果 在 0 .15～ 6 0 0 0 μU范围内 ,胰岛素量与发光强度有良好的线性关系 ,r=0 .9972 (P <0 .0 1) ,检测限为 0 .0 42 μU ;精密度为3.36 %～ 11.88% ,回收率为 92 .13%～97.87% ;免疫柱可在 1个月内反复使用 2 0 0次以上 ;本法测定胰腺提取液试样的结果 ,与放射免疫分析法的测定结果基本一致。结论 建立的胰岛素测定方法快速灵敏、特异性强、重现性好、操作简便、易于自动化 ,并且无放射性污染 。

胰岛素样生长因子-Ⅰ在非酒精性脂肪肝病变中的变化

目的研究血清胰岛素样生长因子Ⅰ(IGFⅠ)与非酒精性脂肪肝的关系。方法采用夹心酶联免疫分析的方法测定60例非酒精性脂肪肝患者和40名健康对照血清IGFⅠ水平,并比较两组IGF1、血脂[胆固醇(Chol)、三酰甘油(TG)]、空腹血糖(Glu)、丙氨酸转氨酶(ALT)的测定结果。结果脂肪肝组的血清IGF1水平为(162.0±46.6)ng/ml,健康组血清IGF1水平为(189.0±37.4)ng/ml,结果差异具有显著性(P<0.01)。两组的TG、Glu差异也有显著性(P<0.05),其他指标差异无显著性。结论非酒精性脂肪肝患者的IGF1水平下降与脂肪肝的形成有关,同时可能加重凋亡对已发生脂肪变性的肝细胞的损伤。

多通道电化学传感器检测人血清总前列腺特异性抗原

目的建立一种简便、灵敏和准确的多通道电化学传感器分析方法（ECISA）,用于人血清总前列腺特异性抗原（tPSA）的检测,并进行性能评价。方法基于抗体真空组装技术,将抗PSA抗体在16通道碳印刷电极阵列表面进行自组装,结合双抗体夹心免疫分析原理和多通道电化学传感技术对185份人血清中的tPSA进行检测,并将结果与电化学发光免疫分析法（ECLIA）进行相关性分析。结果多通道电化学传感技术检测tPSA标准曲线的线性范围为0.05-50 ng/mL;tPSA的最低检测限为10 pg/mL;定量限为61 pg/mL;检测tPSA批内变异系数（CV）为8.00%-8.50%;与ECLIA定量结果相关性良好（r2=0.941,P〈0.01）。结论 ECISA技术检测tPSA的灵敏度和特异性均较高,且与ECLIA结果有较好的相关性,能满足临床对tPSA检测的要求,具有潜在的临床推广应用价值,并具备用于其他肿瘤标志物检测的前景。

基于量子点标记技术的鸡新城疫病毒sFLISA检测技术研究

本研究建立了基于量子点的鸡新城疫病毒(NDV)sFLISA检测方法。该方法以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体、以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体、以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。该方法与其它有关禽类病毒(产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒)无交叉反应,比血凝试验灵敏,为临床早期快速检测NDV提供了行之有效的方法。

幽门螺杆菌粪便抗原检测——一种新的非侵入性检查

目的:了解幽门螺杆菌粪便抗原检测方法(Helicobacter pylori stool Antigen HpSA)的准确性与可靠性。方法:采用酶联免疫分析“双抗体夹心法”对303例因上消化道症状而进行胃镜检查的患者的粪便标本进行幽门螺杆菌检测,以快速尿素酶试验,组织学染色和培养检测Hp,以三项检查中至少两项阳性或Hp培养检测阳性者判定为Hp感染作为“金标准”。结果;“金标准”诊断Hp感染阳性182例,阴性121例。“金标准”阳性的182例中176例HpSA检测阳性,阴性的121例中100例HpSA检测阴性,HpSA敏感度为96.7％(176/182),特异度为82.6％(100/121)。结论:HpSA检测是一种简便易行,准确性高的非侵入性诊断Hp的方法,值得临床进一步推广。

胃癌手术前后血浆PAI-1、t-PA水平及临床价值

目的:探讨胃癌患者手术前后血浆PAI-1、t-PA含量变化及临床价值。方法:采用双抗体夹心酶标免疫分析法,测定胃癌患者手术前后血浆PAI-1、t-PA与肿瘤转移和预后的关系。结果:胃癌术前PAI-1、t-PA均与非肿瘤对照组差异有统计学意义(P<0.05),行胃癌根治术后t-PA水平较术前差异有统计学意义(P<0.05);胃癌患者转移和无转移者PAI-1水平有统计学差异,而t-PA变化不大(P>0.05)。结论:血浆PAI-1、t-PA水平与胃癌的浸润及转移过程密切相关。

不同面积脑梗死患者血清血管内皮生长因子水平比较

探讨脑梗死面积与血清血管内皮生长因子的关系。对50例急性脑梗死患者(发病16 h以内)于入院即时、入院后第1、3、7和14天分别测定血清血管内皮生长因子水平;根据入院后第3天头颅计算机体层摄影术扫描结果,将脑梗死分成大、中、小三种类型梗死面积,比较三种类型梗死面积各时相血清血管内皮生长因子水平。结果发现,三种面积脑梗死患者血清血管内皮生长因子升高的程度在入院即时、病后第1-7天有显著性差异(P<0.05)。结果提示,血清血管内皮生长因子水平与脑梗死面积有关,其水平随面积增大而增高,并在发病早期即可检测出来。

糖尿病肾病患者血清Ⅳ型胶原的临床观察

用夹心酶联免疫分析方法对Ⅱ型糖尿病患者 40例、正常对照组 3 0例的血清中完整的Ⅳ型胶原分子进行检测。观察其与糖尿病肾病之间的关系 ,并将其与血肌酐水平、内生肌酐清除率进行相关性分析。结果正常对照组的血清Ⅳ型胶原水平为 89 663 +8 445ng/ml,Ⅱ型糖尿病患者为 472 986± 2 2 7 1 43ng/ml,显著高于正常对照组 (P <0 0 1 )。随着糖尿病肾病的进展 ,血清Ⅳ型胶原水平逐步增加 ,血清IV型胶原水平同血肌酐水平、内生肌酐清除率无相关性 (r=0 0 1 3 0和r=0 0 2 3 2 ,P >0 0 5 )。结论血清Ⅳ型胶原浓度反映了Ⅱ型糖尿病患者Ⅳ型胶原合成的增加 。

子宫内膜异位症患者血清中EPO及ENA-78的表达及意义

目的研究促红细胞生成素(EPO)及中性粒细胞激活肽-78(ENA-78)在子宫内膜异位症中的意义及相关性。方法采用双抗体夹心酶联免疫分析方法测定34例子宫内膜异位症患者(Ⅰ、Ⅱ期12例,Ⅲ、Ⅳ期22例)和30例非子宫内膜异位症患者血清中EPO及ENA-78的表达,并分析子宫内膜异位症患者血清中E-PO及ENA-78的相关性。结果子宫内膜异位症患者血清中EPO及ENA-78的表达量均明显高于对照组(P<0.05);血清中EPO的表达量Ⅰ、Ⅱ期子宫内膜异症患者稍高于Ⅲ、Ⅳ期患者,但差异无统计学意义(P>0.05);血清中ENA-78表达量Ⅲ、Ⅳ期子宫内膜异症患者明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜异症患者血清中EPO与ENA-78的表达无明显相关。结论EPO及ENA-78与子宫内膜异位症的发病有关。

巨-内皮素-1的研究进展

内皮素（ET）系一族具有血管收缩的内源性肽类。它在维持正常血循环功能上有重要作用，是近期研究心血管系统疾病发病机理的一个热点。血浆中内皮素增高是血管内皮细胞（EC）受损敏感指标之一。近期Aubin等发观测定ET-1的前体-巨-内皮素-1（BigET-1）比目前国内外常测项目ET－1，其敏感性、特异性及稳定性更好，而且与ET－1及其他异构肽无或仅有极低的交驻反应，国外期刊《临床化学》评论认为：Big-ET-1的测定为研究血管内皮受损提供了最有价值的研究手段，是近期检验项目的一大突破。

基于二氧化硅-硫堇纳米复合物构建高灵敏癌胚抗原电流型免疫传感器

利用电沉积纳米金(AuNPs)修饰玻碳电极(GCE)表面并通过AuNPs固定癌胚抗原(CEA)的捕获抗体(Ab1),以牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点;以γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPMS)作交联剂,将单分散的SiO_2纳米粒子与电子媒介体硫堇(Thi)结合成SiO_2-Thi纳米复合物,偶联辣根过氧化物酶(HRP)标记的CEA二抗(HRP-Ab2)作为电化学免疫检测信号,构建了具有信号放大效应的电流型免疫传感器并用于CEA的高灵敏检测。在CEA存在下,进行电化学酶联夹心免疫反应。在含有H2O2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,标记在SiO_2-Thi纳米复合物上的HRP能催化H_2O_2氧化电子媒介体Thi,产生增强的还原峰电流,从而提高检测CEA的峰电流响应信号,进而实现对CEA的高灵敏电化学酶联夹心免疫分析。在最优实验条件下,该免疫传感器的差分脉冲伏安(DPV)还原峰电流与CEA质量浓度的对数在0.01~20ng/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为3pg/mL(S/N=3)。该传感器对血清样品进行加标回收实验,回收率为97.3%~105.7%,可初步用于临床对CEA的检测。