核酸夹心杂交法半定量检测人IL-1α mRNA

目的 建立一种半定量检测人外周血单个核细胞 (PBMC)表达IL 1αmRNA的方法。方法 确定RT PCR反应体系及扩增循环的各项参数 ,确定酶联夹心杂交反应所需的试剂、试剂的配制及杂交反应的温度、时间。选择最适数量的PBMC进行RT PCR并用核酸夹心杂交法检测扩增产物。结果 本方法检测IL 1αmRNA的灵敏度明显高于RT PCR琼脂糖凝胶电泳 ;无非特异性阳性信号出现 ,重复性良好 ,操作简便。结论 本方法是一种较好的定量检测IL 1αmRNA的方法 。

微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,定量检测人IL 18mRNA。方法 :针对人IL 18mRNART PCR产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端为氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔板内 ;另一条为检测探针 ,3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA ,进行RT PCR扩增IL 18mRNA ,产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交 ,再加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后经亲和素 辣根过氧化物酶 (SAV HRP)系统检测杂交信号。结果 :该法检测IL 18mRNART PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,重复性良好 ,且结果数据化。结论 :该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点 ,适合于PCR扩增产物的定量检测。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

微量酶联夹心杂交法定量检测TNF-αmRNA

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术，对人单核细胞分泌的TNF－αmRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5’端带有氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，而且是“竖直”地包被在微孔内，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA，RT－PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中，加入检测探针与已杂交的产物结合，最后加入亲和素一辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)显色系统催化底物显色，450nm波长下检测吸光度进行定量。结论：该方法检测TNF－αmRNA的灵敏度，明显高于琼脂糖凝胶电泳，而且具有良好的重复性，等量PCR产物作10个复孔，吸光度的CV值为7．2％，批间的CV值为9．1％。在本实验中，我们疼守试着用客观的数据来表示正常人中1×10^5个BPMCs中TNF－αmRAN的平均表达量,发现该表示方法直观明了，结果稳定， 而且简便可行，不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论：本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作，结果数据化等优点，适合于微量细胞因子mRNA的定量检测。

分子探针-酶联夹心杂交法测定水中微囊藻

微囊藻是分布最广的一类水华蓝藻,研究、建立微囊藻的快速检测方法具有十分重要的意义。针对藻蓝蛋白的基因间隔区域序列设计了一组可用于检测微囊藻种属的特异性探针,以实验室培养的微囊藻Microcystis aeruginosa为研究对象,建立了一种检测微囊藻的夹心杂交法。将该法用于华中科技大学校园内的景观湖———镜湖水样的检测,结果与显微镜观察和全细胞PCR的结果一致,表明试验建立的方法是有效的。

基于mcyJ基因序列的酶联夹心杂交法检测产毒微囊藻

微囊藻是分布最广的一类水华蓝藻,多数都能产生微囊藻毒素。研究、建立产毒微囊藻的快速检测方法具有十分重要的意义。针对藻毒素合成基因mcyJ设计一组可用于产毒微囊藻种属的特异性探针,以实验室培养的微囊藻FACHB 905为研究对象,建立了一种检测产毒微囊藻的酶联夹心杂交法,并对酶联夹心杂交实验中的杂交液成分、浓度,杂交时间、温度以及酶联反应时间和温度等反应条件逐一进行了优化,建立了该方法的标准曲线,相关系数为0.997。