改良双抗体夹心酶联免疫法测定重组人活性蛋白C含量的研究

研究用ELISA法直接定量检测细胞培养液中的重组人活性蛋白C(rhAPC)。用改良双抗体夹心酶联免疫检测法进行定量分析。用棋盘滴定法对包被抗体、反应一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗的适宜工作浓度进行了选择,并对实验条件进行优化,参考品标准曲线线性相关性较好。改良双抗体夹心酶联免疫检测法可用于直接定量分析细胞培养液中的rhAPC水平。

加工食品中花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定的前处理方法探究与改进

目的构建一种可配合花生蛋白夹心酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒实现对于加工食品中花生成分可靠检测的高质量样品前处理方法。方法对9种不同pH的提取缓冲液提取未处理、湿热处理、干热处理花生蛋白效果进行比较分析以确定最优提取缓冲液类型。而后,将吐温-20、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)以单独或组合添加的方式加入上一步获得的最优提取缓冲液中,提取3组花生蛋白,并对提取效果与夹心ELISA试剂盒检测花生蛋白回收率进行比较分析以确定最优添加剂配方。结果最终确定添加0.2%SDS和0.1%吐温-20的碳酸盐缓冲液(50 mmol/L,pH 9.6)为最优提取缓冲液。向碳酸盐缓冲液中加入SDS、吐温-20较好地提升了花生蛋白的提取率和回收率,将湿热处理花生蛋白回收率提高了2倍以上。结论本研究实现了对商业加工食品中花生成分的可靠检测,为推动过敏原信息在食品标签的准确标注提供了技术支撑,也为相关研究提供了参考。

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。

转基因作物pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法研究

将克隆到的pat基因构建原核表达载体pET30（＋）-pat并在大肠杆菌中进行表达，分离纯化得到高纯度pat蛋白。用所得到的pat蛋白制备了兔多克隆抗体和鼠单抗2F6。多抗效价〉8000，单抗效价为5×10^4；单抗为IgGl类，轻链为，（型。基于抗pat蛋白单克隆抗体和兔多克隆抗体建立了双抗夹心酶联免疫分析方法（SandwichELISA）。检测范围为1．6～100μg／L，线性回归方程y=0．6914x-2．572，决定系数为0．9951。用所建立的方法测定了5个转基因抗虫棉和2个非转基因棉花品种叶片中pat蛋白的含量，其中转基因抗虫棉中的3个品种检测出pat蛋白，其余均未检出pat蛋白。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测鱼糜制品中鸡蛋卵白蛋白

目的建立双抗体夹心酶联免疫吸附(sandwich enzyme linked immunosorbent assay,sELISA)法检测鸡蛋卵白蛋白(ovalbumin,OVA)的方法,组装定量检测鱼糜制品中OVA含量的ELISA检测试剂盒。方法确定各步骤反应时间,使用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度,建立检测方法并对其性能进行评价。结果反应最佳条件为:抗原孵育20 min,检测抗体孵育20min,酶促反应显色10 min。兔抗OVA抗体为捕获抗体,工作质量浓度为1μg/mL,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗OVA抗体为检测抗体,1:5000(V:V)稀释。采用四参数逻辑曲线拟合标准曲线,所建立sELISA方法的检测范围为8.5~200.0 ng/mL,检出限为3.5 ng/mL,定量限为8.5 ng/mL。批次内和批次间的变异系数分别为2.31%~4.58%和6.06%~12.23%;鱼糜基质中的回收率为80%~130%;测得28种常见食物样品中4种样品的交叉反应率小于0.002%;试剂盒在4℃保存6个月期间,标准品检测结果的变异系数为4.29%~18.91%。结论建立的方法快速、灵敏、准确、稳定性好,可用于鱼糜制品中鸡蛋OVA的定量检测。

抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli L-天冬酰胺酶及药代动力学研究

目的 建立大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶的抗体夹心酶联免疫吸附测定法 ,并进行药代动力学研究。方法 应用重组E .coliL 天冬酰胺酶免疫家兔 ,分离IgG ,用DEAE 纤维素柱色谱纯化 ,辣根过氧化物酶标记抗体 ,建立抗体夹心酶联免疫吸附法 ,测定大鼠血浆中重组E .coliL 天冬酰胺酶浓度。结果 方法的线性范围为 1～6 4U·L- 1 ,血药浓度与时间的关系符合二房室模型 ,初期和末端的T1 2 分别为 0 5 0～ 0 5 7h和 2 4 5～ 3 0 2h ,AUC与剂量成正比。结论 建立的抗体夹心酶联免疫吸附法在灵敏度、特异性、线性范围、精密度和回收率等方面 ,满足药代动力学研究要求。实验方法和重组E .coliL

酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG

〔目的〕建立检测牛初乳素为原料的保健食品中免疫球蛋白IgG的常用酶联免疫双抗体夹心法。〔方法〕分离纯化小牛血清中IgG,以牛IgG免疫新西兰兔,获得抗牛IgG的血清,分离纯化,制备兔抗牛IgG。〔结果〕1000ng/孔兔抗牛IgG饮被酶联板,3倍比稀释牛IgG,夹心法检测。〔结果〕在牛IgG0.031mg/ml-2.50mg/ml范围,浓度与吸光度值线性相关,方程为:y=0.358+0.767x,相关系数为r=0.995,当添加50mmIgG时,回收率为88.4％,变异系数为6.1％。〔结论〕该方法具有特异性强、快速、灵敏和分析成本低等特点。

酶联免疫吸附分析双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起5周岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原体.目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的7项呼吸道病毒检测试剂盒,但其价格昂贵,且需荧光显微镜辅助诊断,不利于在基层医疗机构中推广,国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测.为此建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂,并以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测为参比,同时使用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床鼻咽抽吸物(NPA)样本进行检测.ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%和74.14%,特异度分别为100%和96.30%,Kappa值分别为0.787 1和0.689 5,两者均与RT-PCR检测结果具有高度一致性.此外,将ELISA双抗夹心法与免疫荧光法比较,两者无显著差异(p>0.05).综上,ELISA双抗夹心法操作简便,特异性高,有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断.

酶联免疫吸附试验夹心法检测解脲脲原体方法的建立

目的为了提高解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)检测的快速性。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法检测UU抗原并与传统的培养法相比较。结果ELISA夹心法敏感度为92.6%,特异度为97.4%,最低能够检测出蛋白含量为5～10ng/ml的UU抗原。结论ELISA夹心法是一种敏感、方便、快捷、适合大规模标本检测解脲脲原体的方法。

酶联免疫荧光法与双抗夹心酶联免疫吸附法测定屋尘螨组分IgG4的比较

目的运用酶联免疫荧光法（UniCAP法）和双抗夹心酶联免疫吸附法（Fooke法）分别测定经特异性免疫治疗（SIT）的患儿血清sIgG4水平,评价两种免疫定量检测方法的相互关系。方法对45例成功进行皮下SIT的患儿血清分别用UniCAP法和Fooke法检测治疗前、治疗6~8个月后、治疗12~14个月后sIgG4水平。结果与治疗前相比较,在治疗6~8个月和治疗12~14个月后,UniCAP法检测45例患儿血清sIgG4水平全部均有不同程度升高,Fooke法在SIT后6~8个月和12~14个月后分别有40和43例患儿sIgG4水平有不同程度升高,但两种方法检测sIgG4结果升高幅度有差异。结论对于sIgG4测定,SIT后,Uni CAP法比Fooke法测定值升高的幅度更明显。

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测杏仁过敏原苦杏仁球蛋白

提取中国甜杏仁过敏原蛋白苦杏仁球蛋白,分别制备兔和鼠多克隆抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法。结果表明:对甜杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限为(6.36±1.02)μg/L;对中国苦杏仁及美国大杏仁中苦杏仁球蛋白的检测限分别为(12.11±1.70)μg/L和(18.95±1.52)μg/L,且与常见的14种植物性蛋白没有交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。将该方法用于法式小面包、饼干和脱脂牛乳中杏仁过敏原的检测,苦杏仁球蛋白的添加回收率为78.94%～125.15%,且相对标准偏差均低于5.81%。

双抗夹心法酶联免疫吸附试验影响因素探析

目的探析双抗夹心法酶联免疫吸附试验中牛血清清蛋白封闭,吐温20及浓度,样品与检测抗体的加样方式及孵育温度对酶联免疫吸附试验检测结果的影响。方法双抗夹心法酶联免疫吸附试验检测人白细胞介素(IL)-1Ra细胞因子作为模型,检测封闭条件,吐温20及其不同浓度,样品与检测抗体分开孵育及共同孵育,酶联孵育温度对标准品浓度与OD值关系的影响。结果酶联免疫吸附试验不封闭、洗液吐温浓度为0.05%且孵育温度为37℃的R^2=0.995 7;BSA封闭的R^2=0.981 1;洗液中吐温浓度0.005%时R^2=0.991 5,0.5%时R^2=0.9868;样品和检测抗体一同孵育1h或2h的R^2分别为0.964 5和0.874 2;孵育温度为25℃的R^2=0.996 1。结论BSA封闭步骤对低浓度的样品检测灵敏度不强;样品和检测抗体及酶稀释液中必须含有吐温20且浓度在0.05%条件下最合适;样品和检测抗体共同孵育会影响对高浓度样品的检测;37℃和25℃的孵育温度条件下的酶联免疫吸附试验检测灵敏度没有差异,但25℃孵育可以降低OD值背景。

黄瓜绿斑驳花叶病毒病快速检测法与酶联免疫双抗体夹心检测法的比较及其在生产上的应用

采用快速检测法(浙江大学和安德珍各自生产的试剂盒)和酶联免疫双抗体夹心法对棚栽嫁接西瓜疑似感病植株叶片和显症植株叶片进行黄瓜绿斑驳花叶病毒检测,结果发现,疑似感病叶片中,阳性率:DAS-ELISA法86.36%>浙大快速检测法59.09%>安德珍快速检测法34.09%,DASELISA法与快速检测法之间的阳性率差异极显著(χ~2=25.03,P<0.01),与浙大快速检测法符合率72.72%,与安德珍快速检测法符合率为47.72%,2家快速检测法之间的阳性率有显著性差异(χ~2=4.57,P<0.05);显症病叶中,阳性检出率浙大快速检测法高于安德珍快速检测法,当样品在冰箱中保存后,快速检测法的阳性检出率会下降,影响检测结果。

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

酶联免疫双抗原夹心法检测抗双链DNA抗体

DNA)抗体是一种自身抗体,主要在系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中出现,特别是活动期病人血清中,是诊断SLE特异性的检测指标.目前检测抗ds-DNA的方法有许多,以放免与ELISA法最为简便.但都以无法得到纯双链DNA作为检测抗原而受到限制,检出的结果受抗单链DNA(SS-DNA)抗体的干扰,假阳性率高,特异性差.

抗体夹心酶免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3研究

将重组E. coli水蛭素HV3和BSA交联后免疫豚鼠和家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG.用这两种抗体和酶标二抗羊抗兔IgG-HRP建立三抗体夹心酶联免疫吸附法,测定重组E. coli水蛭素HV3的含量.本测定方法的线性范围为0～2 ng/ml,灵敏度为0.04 ng/ml.建立的三抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性.

牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

将牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G,Ig G）作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选获得分泌抗牛Ig G单克隆抗体的细胞株。制备小鼠腹水抗体,进一步纯化获得抗牛Ig G单克隆抗体。建立双抗夹心酶联免疫吸附法检测牛初乳中Ig G质量浓度,该方法在7.8~1 000 ng/m L范围内有良好的线性关系,最低检出限为7.06 ng/m L,批内变异系数为4.52%,批间变异系数为4.94%,回收率为91.85%~102.45%。此法操作简便、准确度高、稳定性好,可用于实际牛初乳样品的快速检测。

大鼠血浆中重组人钙调磷酸酶B亚基的ELISA双抗体夹心法测定及其药动学研究

目的:建立大鼠血浆中重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的测定方法,并研究其药动学特征。方法:采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法,将1μg/ml的rhCNB单克隆抗体mAb包板,加入待测样品,再加入rhCNB多克隆抗体pAb(稀释比例为1∶5 000)和辣根过氧化酶(HRP)标记抗免疫球蛋白G(IgG)(稀释比例为1∶10 000),以四甲基联苯胺显色,用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(OD值)。测定6只大鼠iv 2.5 mg/kg rhCNB后2、15、30、60、120、240、480、720 min的血药浓度,以BAPP 3.0软件计算药动学参数。结果:rhCNB检测质量浓度的线性范围为0.195~12.5 ng/ml(r^2=0.995 0),定量下限为0.195 ng/ml,准确度为97.300%~103.622%(RSD均小于7.5%,n=6);批内、批间和反复冻融3次的RSD均不大于8.5%(n=6、18、15)。该药在大鼠体内的药动学特征符合二室模型,AUC_(0-720 min)为173.038 mg·min/L、t_(1/2)为94.62 min。结论:建立的方法特异性强、灵敏度高、准确度及精密度好,可用于生物样品中rhCNB的定量检测和药动学研究。