菌物生物技术:外源蛋白在米曲霉中的表达及分泌(英文)

米曲霉是与工业用酶及食品发酵相关的重要微生物，其分泌蛋白的能力有望将其用于外源蛋白表达的遗传工程研究。为了构建米曲霉的转化系统，首先由紫外照射，分离获ａｒｇＢ－突变株，再通过ＣａＣｌ２调节的化学方法和电穿孔技术将携带构巢曲霉ａｒｇＢ基因的质粒导入米曲酶受体细胞，经筛选获得多拷贝及遗传稳定的转化子，转化频率为１０～５０转化子／μｇＤＮＡ。虽然构巢曲霉与米曲霉ａｒｇＢ基因的同源性不高，但前者对后者ａｒｇＢ－突变能起到补偿作用。在电场调节的转化中—电穿孔，适宜条件为６．３ｋＶ／ｃｍ和１５４０ｏｈｍ。电场中，原生质体相对于非原生质体在１．３ｋＶ／ｃｍ条件成活率为８０％，而６．３ｋＶ／ｃｍ下为５０％。为了实现外源基因在米曲霉中的表达，天然植物源的蜜饯—奇甜蛋白基因及构巢曲霉中作为营养选择标记的ａｒｇＢ通过共转化被引入受体细胞中，然后从培养基中获得与纯化的奇甜蛋白相似的具免疫活性的２２ｋＤａ分子量的蛋白质，这说明植物中的信号序列同样可在米曲霉中起作用，调节奇甜蛋白分泌到细胞外。