奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核细胞中的表达研究

为了研制奈瑟氏淋球菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(NeisseriasurfaceProteinA ,NspA)的核酸疫苗 ,根据淋球菌NspA的基因序列 ,设计一对寡核苷酸引物。以淋球菌WHO A菌株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得具有完整开放读码框架 (ORF)的NspA基因 ,并将其正向插入真核表达载体pCMVscript,成功构建了表达NspA基因的真核细胞表达载体pcNspA。用脂质体包裹pcNspA重组质粒转染COS细胞 ,以间接免疫荧光分析法分析NspA基因的表达 ,发现转染pcNspA的COS细胞能高表达NspA抗原。淋球菌免疫保护性抗原NspA基因的克隆与真核细胞表达 。

奈瑟氏淋球菌IgA蛋白酶基因的克隆

IgA蛋白酶(IgA protease)可由多种病原微生物产生并分泌,例如肺炎双球菌(Haemophilus),奈瑟氏菌(Neisseria)等。其中奈瑟氏菌的IgA蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类,其切割底物的核心序列为—ProPro/XxxPro,其中Xxx可以是Thr、Ala和Ser三个氨基酸中任何一种。IgA蛋白酶的切割具有特异、高效的特点,另一突出优点是它可用重组大肠杆菌进行表达制备。

脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A的克隆表达及血清学分析

目的构建并表达功能性的脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白A(NspA)的重组蛋白,并检测流行性脑脊髓膜炎(流脑)恢复期患者血清中的抗NspA抗体水平,探讨NspA作为新的流脑抗原疫苗的意义。方法从流脑患者流行株中克隆NspA基因构建原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,GSTrap FF亲和层析纯化出具有生物活性的NspA融合蛋白。采用纯化得到的NspA融合蛋白检测流脑恢复期患者血清中的抗NspA抗体。结果成功表达了功能性NspA蛋白,相对分子质量(Mr)为44 000。并用NspA融合蛋白检测到患者恢复期血清中存在有抗NspA抗体,且滴度为1∶40时,阳性率为90%。结论成功表达了NspA重组蛋白,并检测到自然感染流脑患者恢复期血清中的NspA抗体。

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础。用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pEG30a中,转入BL21中表达。经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了ltB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达。ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础。

淋球菌外膜抗原的免疫原性

淋球菌的唯一宿主是人 ,在漫长的进化过程中淋球菌形成了一套逃避人体免疫系统的机制。尽管如此 ,人们却一直试图筛选有保护作用的淋球茵外膜抗原用于疫苗研究 。

淋球菌nsp A基因原核重组质粒的构建及表达

目的:构建奈瑟淋球菌表面蛋白A(Neisseria surface proteinA,NspA)基因原核表达载体,并诱导NspA融合蛋白在宿主菌BL21(DE3)中表达。方法:根据基因库报道的淋球菌nsp A基因序列,设计合成一对引物;以淋球菌基因组DNA为模板,PCR扩增淋球菌Nsp A基因;将PCR扩增产物与带有谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)基因的高效原核表达质粒pGEX4T-1定向重组,构建原核表达重组体pGEX4T-1-NspA;重组体经酶切、PCR鉴定和核酸序列分析正确后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)及Western blot技术检测重组蛋白表达情况。结果:重组体pGEX4T-1-Nsp A经BamHⅠ、XholⅠ双酶切、PCR和核酸序列分析表明:成功构建淋球菌Nsp A基因原核表达重组体pGEX4T-1-Nsp A;SDS-PAGE及Western blot分析显示:重组Nsp A基因在原核系统中得到了表达,融合蛋白GST-Nsp A约44 ku。结论:淋球菌Nsp A基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究淋球菌Nsp A蛋白免疫学性能和研制淋球菌疫苗提供了研究基础。

LTB-NspA融合基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建融合基因LTB-NspA的原核表达载体。方法:用PCR法从淋球菌和大肠杆菌标准株分别扩增出NspA和LTB基因,用重组PCR法通过接头将LTB与NspA融合,将其插入pET-30 a中,并进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:经PCR、酶切和测序分析,证实成功构建了LTB-NspA的原核表达载体。结论:LTB-NspA原核表达载体的成功构建,为研制淋球菌高效粘膜免疫疫苗奠定了基础。

粘膜佐剂LTB优化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻饲免疫效果研究

目的:用真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫小鼠,探索粘膜佐剂LTB辅佐NspA所诱发的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平。方法:对真核重组质粒行PCR及双酶切鉴定后大量制备,经鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平及小鼠生殖道灌洗液中NspA特异性sIgA抗体水平;MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。结果:融合基因pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组小鼠生殖道灌洗液中sIgA(A450:0.316±0.045)明显高于pcDNA3.1(-)/nspA单基因组(P<0.05)和其它对照组(P<0.01);小鼠血清中IgG(A450:0.643±0.156)水平、脾淋巴细胞刺激指数(SI:1.65±0.32)和脾淋巴细胞诱生的IFN-γ(160.56±25.67pg/ml)水平均明显高于pcDNA3.1(-)/ltB、空质粒pcDNA3.1(-)和PBS对照组(P<0.01)。结论:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗经鼻饲免疫,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答;粘膜佐剂LTB可辅佐NspA诱导小鼠产生更高水平的生殖道粘膜免疫。

病原细菌

0200512 从西班牙乳球菌暴发中分离的乳球菌garvieae属的原生型及遗传的特征和与其他国家及来源的分离物的比较/Vela A I∥J Clin Microbiol.-2000,38(10).-3791～3795 医科图0200513 嗜温性亲水气单胞菌孔蛋白Ⅱ的克隆、测序和在血清敏感性中的作用/Nogueras M M∥Infect Immun.-2000,68(4).-1849～1854

病原菌

0020141 肠道细菌如何引起疾病/Guer-rant R L∥J Infect Dis.-1999,179(suupl 2).-S331～337 医科情0020142 细胞内细菌如何生存:表面诱变变异促进对宿主固有的免疫反应的抵抗力/Ernst R K∥J Infect Dis.-1999,179(Su-upl 2).-S326～330