构巢曲霉奎尼酸脱氢酶基因qutB在大肠杆菌中的克隆与表达

从莽草酸途径合成奎尼酸(QA),奎尼酸脱氢酶(QDHase)是必须的,大肠杆菌基因组不含有该酶的编码基因,在构巢曲霉(Aspergillusnidulans)中存在qutB基因编码此酶。以构巢曲霉染色体DNA为模板,采用PCR扩增得到qutB基因,在大肠杆菌中进行了克隆表达。结果表明,该基因在λ噬菌体的PRPL串联启动子驱动下实现了QDHase的表达。SDS-PAGE显示,重组菌热诱导后表达出大小约36000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的19.81%。经酶活性测定,表达产物具有生物学活性,与对照菌株相比,其酶活性提高了27.8倍,为进一步奎尼酸生物合成研究奠定了基础。

脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达

目的:构建共表达载体pETDuet-aroB-qutB,在大肠杆菌中同时表达奎尼酸合成途径中的关键酶脱氢奎尼酸合成酶(DHQase)和奎尼酸脱氢酶(QDHase)。方法:分别以大肠杆菌(B21)和构巢曲霉(ATCC 24919)基因组为模板,采用PCR法扩增得到脱氢奎尼酸合成酶基因aroB和奎尼酸脱氢酶基因qutB,克隆接入pETDuet-1载体中,转化入大肠杆菌BL21,在宿主菌中共表达脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶。结果:获得了包含pETDuet-aroB-qutB共表达载体的重组大肠杆菌。IPTG(0.5 mmol/L)诱导重组菌4 h后,脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶表达量分别占菌体总蛋白的18.7%和30.5%,酶活力为70.4 U/L、40.2 U/L,分别提高了14.1倍和22.3倍。结论:实现了脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效共表达,为基因工程法生物合成奎尼酸奠定了基础。

qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达

奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3kJ/mol降低到最小-80.5kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。

茶树中莽草酸途径DHD/SDH基因的表达调控

3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶（DHD/SDH）是茶树莽草酸途径中唯一的双功能酶，一方面催化生成莽草酸，另一方面可以催化生成没食子酸. 为研究DHD/SDH基因在茶树代谢途径中表达及调控模式，通过在线预测、RLM-RACE和qPCR技术探讨miRNA对DHD/SDH的调控及表达模式. 在获得的茶树miRNA序列的基础上，对本试验室克隆得到的茶树3个DHD/SDH进行miRNA预测和鉴定. 获得了4个miRNA参与裂解CsDHD/SDH基因. 其中miR5180b、miR1510b-5p和miR^24共同靶向CsDHD/SDH2，miR868-5p作用于CsDHD/SDH3. 同时对茶树中3个CsDHD/SDH表达模式进行检测. 不同激素处理下，CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3表达模式一致. CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3的表达模式存在协同作用. 本研究表明CsDHD/SDH1与CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之间的表达存在负反馈调节，CsDHD/SDH1上调表达时会导致互补基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下调表达. （图4 表2 参25）

大肠杆菌aroE基因的克隆与表达

目的:克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性。方法:根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性。结果:构建了aroE基因的克隆和表达重组子,aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE图谱显示新增30×103蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍。结论:实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础。